[發明專利]一種血清4型禽腺病毒滅活苗及其制備方法

在審

• 申請號: 201611102065.2
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN106692964A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 葉建強;張建軍;李文跡;張偉;秦愛建;殷健;高巍;邵紅霞;梁廣成
• 申請（專利權）人: 揚州大學;國藥集團揚州威克生物工程有限公司;福建圣維生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/235
• 分類號: A61K39/235;A61P31/14;C12N7/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于疫苗制備技術領域，具體涉及一種基于懸浮培養技術的血清4型禽腺病毒滅活苗。

背景技術

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，分為5個種(A-E)，12個血清型。雖然在世界各地均有報道，FAdV感染一般引起亞臨床狀況，而急性感染主要引起包涵體肝炎、心包積液以及肌胃糜爛等。自2013年，國內雞群由FAdV引起的包涵體肝炎、心包積液病例逐漸增多。到2015年，FAdV感染在國內多個省份雞群爆發。目前FAdV爆發不僅發生在3-4周齡肉雞，還發生于10-20周齡的蛋雞，給國內養雞業造成了嚴重經濟損失。病毒分離鑒定發現，目前高致病性血清4型FAdV在國內雞群流行較廣泛。然目前尚無針對血清4型FAdV的商品化疫苗。在疫苗的研制中，病毒效價的高低不僅影響免疫效果，而且直接影響疫苗成本及價格。病毒的雞胚接種是禽用病毒疫苗常用的擴增技術。雖然血清4型FAdV病毒能在雞胚中生長復制，但是雞胚中擴增的血清4型FAdV病毒滴度較低，不能滿足疫苗生產高效價的要求。另外，血清4型FAdV病毒雖然能在雞肝細胞中有效復制，但是普通細胞培養也很難滿足疫苗的規模化生產要求。病毒的懸浮培養技術可大大提高病毒效價，是高效價病毒疫苗規模化生產的發展趨勢。

發明內容

本發明的目的是在于提供一基于懸浮培養技術的血清4型禽腺病毒滅活苗。本發明的原理和最核心的關鍵技術是利用雞肝細胞，通過激流式生物反應器懸浮培養技術高效擴增血清4型禽腺病毒，并研制出高效價血清4型禽腺病毒滅活苗。

一種基于懸浮培養技術的血清4型禽腺病毒滅活苗，所述的滅活苗的抗原為通過懸浮培養方法獲得的效價不低于10⁹TCID₅₀/ml的滅活后的血清4型禽腺病毒。

所述的滅活苗的抗原通過下述方法獲得：將血清4型禽腺病毒接種于雞肝細胞，利用激流式生物反應器擴增血清4型禽腺病毒；反應器轉速為40r/min、200g載體初始細胞接種為1×109個、細胞生長液為10％FBS血清的DMEM/F12培養液、病毒感染及維持液為含2％FBS血清的DMEM/F12培養基、最適PH為7.0-7.2、病毒接種量MOI為0.1以及病毒收獲時間為接種后96小時。

本發明還公開了一種制備高效價血清4型禽腺病毒滅活苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)血清4型禽腺病毒懸浮培養：將血清4型禽腺病毒接種于雞肝細胞，利用激流式生物反應器擴增血清4型禽腺病毒；懸浮培養激流式生物反應器主要培養條件參數為：反應器轉速為40r/min、200g載體初始細胞接種為1×10⁹個、細胞培養液為10％FBS血清的DMEM/F12培養液、病毒感染及維持液為含2％FBS血清的DMEM/F12培養基、最適PH為7.0-7.2、病毒接種量MOI為0.1以及病毒收獲時間為接種后96小時；感染后96小時后收集病毒、分裝，并測定病毒效價；

(2)血清4型禽腺病毒滅活苗制備：將以上擴增獲得的血清4型禽腺病毒按終濃度0.1％的比例加入甲醛溶液，置37℃滅活24小時，并進行滅活及無菌檢驗；將滅活血清4型禽腺病毒稀釋至4×10^7.0TCID₅₀/mL，按V/V為4％的比例，向滅活病毒液中加入滅菌吐溫-80，并使吐溫-80徹底溶解，獲得水相；將3份油相導入乳化罐中，同時緩慢加入1份水相進行乳化，制成血清4型禽腺病毒滅活疫苗，分裝。

血清4型禽腺病毒滅活苗免疫保護效果評價：將以上制備的滅活疫苗采用皮下接種方式免疫21日齡SPF雞，并設立未免疫雞；在免疫后21天采血分離血清，測定中和抗體水平。免疫后21天，通過胸部肌肉接種方式對免疫雞進行100個LD50病毒量進行攻毒試驗。攻毒后連續觀察14日，統計免疫保護率。非免疫對照組雞為100％死亡，觀察期內發病雞多表現精神沉郁、羽毛粗亂、食欲不振，剖檢可見心包積液、肝臟病變等相關組織病變；免疫組雞為100％保護，觀察期內未見任何異常現象，剖檢未見腺病毒相關組織病變。

本發明的有益效果體現在：通過懸浮培養技術，研制出高效價血清4型禽腺病毒滅活苗，該疫苗效價可達10⁹TCID₅₀/ml，是傳統雞胚疫苗效價的100倍。高效價血清4型禽腺病毒滅活苗的制備可大大降低疫苗的成本，提供疫苗免疫效果，具有很好的應用前景。

附圖說明

圖1：PCR擴增血清4型禽腺病毒特異性DNA片段