[發明專利]一種液質聯用定量檢測大鼠血漿中葉酸濃度的方法

有效

• 申請號: 201611100027.3
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN106770819B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 戚敏;王本偉;王功霞;王芳;徐玲玲;賈慶文;馬玉奎;劉愛明;逯海燕;劉琳
• 申請（專利權）人: 山東省藥學科學院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
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本發明公開了一種液質聯用定量檢測血漿中葉酸濃度的方法。首先采用蛋白沉淀處理大鼠血漿樣本，以格列本脲為內標運用高效液相色譜?質譜聯用(HPLC?MS/MS)方法檢測大鼠血漿中葉酸的含量。質譜采集方法選用ESI正離子及多反應監測模式(MRM)。該方法葉酸在10～1000ng/ml線性關系良好。方法的回收率在80.0％～95.4％范圍內；批內和批間的準確度為92.7％～111.4％，批內和批間精密度為2.6％～8.3％。該方法重現性好，分析時間短，能滿足葉酸在大鼠血漿中濃度的檢測要求，可用于葉酸片劑藥代動力學研究。

技術領域

本發明屬于生物分析領域，具體涉及一種液質聯用定量檢測血漿中葉酸濃度的方法。

背景技術

葉酸是由蝶啶、對氨基苯甲酸和L-谷氨酸組成的水溶性維生素。葉酸在人體內主要參與嘌呤和嘧啶核苷酸的合成和轉化，參與構成含鐵的血紅蛋白，參與蛋白質的代謝等，是細胞生長和繁殖所必需的物質。臨床上可以用來預防神經管畸形，還可用于治療慢性萎縮性胃炎、抑制支氣管鱗狀轉化以及防治因高同型半胱氨酸血癥引起的冠狀動脈硬化癥、心肌損傷與心肌梗塞等。研究表明，葉酸還能抑制腫瘤細胞中癌基因的表達，從而阻斷惡性腫瘤的進展。目前葉酸在機體內的檢測主要有微生物測定法、放射免疫測定法、色譜分析法等，這些方法都存在一定的局限性，而且也不能滿足大批量樣本的檢測。

發明內容

為了克服現有技術存在的缺陷和不足，本發明提供了一種重現性好、靈敏度高、分析速度快的檢測血漿中葉酸濃度的方法，此法可用于藥代動力學研究，為其臨床給藥提供有益的參考。

一種液質聯用定量檢測血漿中葉酸濃度的方法，包括步驟(1)樣品制備，(2)采用液相色譜-質譜聯用檢測，(3)標準曲線制備，(4)血漿中葉酸濃度測定。

所述步驟(1)樣品制備的步驟包括：取待測血漿樣本，加入內標工作溶液沉淀蛋白，混勻后加超純水混勻，低溫離心，取上清液。

所述內標溶液中內標為格列本脲。

所述步驟(2)采用液相色譜-質譜聯用檢測的步驟包括：

(a)液相色譜條件色譜柱：C18柱；流動相：0.1％甲酸-水(A)與乙腈(B)；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫梯度程序如下：0～0.5min，5％(v/v)B；2.2～3.2min，95％(v/v)B；3.21～6min，5％(v/v)B。

(b)質譜條件質譜采用Agilent 6430三重四極桿質譜儀，電噴霧正離子源，多反應監測分析模式(MRM)。

所述(a)液相色譜條件中，色譜柱為Thermo Accucore C18柱(50mm×2.1mm，2.6μm)，樣品檢測時間：6min；流速：0.3ml/min；進樣量：5μl；柱溫：40℃。

所述(b)質譜條件中，干燥氣：N₂；干燥氣流速：10L/min，干燥氣壓力：40psi，干燥氣溫度：350℃，毛細管電壓：4000V。MRM監測方法參數如下：定量離子對葉酸：[M+H]+m/z442.2/295.1，碎片電壓：100V，碰撞能量：10eV；內標格列本脲：[M+H]+m/z 494.2/369.0，碎片電壓：130V，碰撞能量：9eV。

所述(3)標準曲線制備的步驟包括：分別取100、250、500、1000、2500、5000、10000ng/ml的葉酸標準溶液10μl加入大鼠空白血漿90μl，渦旋得10、25、50、100、250、500、1000ng/ml的標準樣本溶液，按步驟(1)樣品制備的方法制備，取上清液按步驟(2)采用液相色譜-質譜聯用檢測的方法檢測，記錄每個濃度的葉酸對應的峰面積；以葉酸和內標的峰面積比值為縱坐標，以葉酸的濃度為橫坐標X，制備葉酸的線性回歸方程。