[發(fā)明專利]全長骨橋蛋白體外活化樹突狀細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611097613.7
• 申請日: 2016-12-03
• 公開（公告）號: CN106635988B
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 刁宏燕;王琳;崔光瑩;張瓊;侯顯良
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發(fā)明公開了一種全長骨橋蛋白體外活化樹突狀細(xì)胞的方法：在外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液中加入濃度為5g/ml的全長骨橋蛋白稀釋液，放入37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48±2小時(shí)，從而實(shí)現(xiàn)對外周血單個(gè)核細(xì)胞中的樹突狀細(xì)胞的活化；所述外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液與全長骨橋蛋白稀釋液的用量比為：1ml/(50±5)ul。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞生物工程領(lǐng)域，具體為一種骨橋蛋白活化樹突狀細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

全長骨橋蛋白(osteopontin,OPN)作為帶負(fù)電的非膠原性骨基質(zhì)糖蛋白，廣泛的分布于多種組織和細(xì)胞中，其相對分子質(zhì)量約為44kDa，約含300個(gè)氨基酸殘基，骨橋蛋白多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)中包括8個(gè)α螺旋和6個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)，高度保守的RGD基元兩端各有一個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)，分子中心部位是a螺旋結(jié)構(gòu)。全長骨橋蛋白中包括凝血酶裂解位點(diǎn)：RGD序列結(jié)構(gòu)中有RS位點(diǎn)，位于RGD序列羧基端第6位氨基酸殘基所形成的肽鍵，是凝血酶的裂解位點(diǎn)，可將其裂解成45kD及24kD兩個(gè)片斷。其中45kD片斷更能刺激細(xì)胞的黏附和遷移。

OPN廣泛的分布于多種組織和細(xì)胞中，能夠參與組織修復(fù)，自身代謝等功能。正常情況下其表達(dá)甚微的細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、SMC、T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在一些誘導(dǎo)因素下可以大量表達(dá)OPN，包括：(1)高血壓，(2)高血糖，(3)低氧，(4)干擾素，(5)成纖維細(xì)胞生長因子，(6)其他因素。

OPN可表達(dá)于各種組織里，不同細(xì)胞類型也能表達(dá)OPN，如骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(SMC)、活化的T細(xì)胞、MФ和自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞亞群；OPN也存在正常體液里，如血清、乳汁、尿液，膽汁。病理狀態(tài)(免疫性疾病、炎癥和腫瘤)OPN表達(dá)增強(qiáng)，如大腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌及各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系亦能高水平表達(dá)OPN。

外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBMC(peripheral blood mononuclear cell)，指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其它少量細(xì)胞(造血干細(xì)胞等)。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)，因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名，是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells,APC)，它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，未成熟樹突狀細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力，成熟樹突狀細(xì)胞能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。

樹突狀細(xì)胞自身具有免疫刺激能力，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一能激活未致敏的初始型T細(xì)胞的APC。人體內(nèi)大部分樹突狀細(xì)胞處于非成熟狀態(tài)，表達(dá)低水平的共刺激因子和粘附因子，體外激發(fā)同種混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力較低，但未成熟樹突狀細(xì)胞具有極強(qiáng)的抗原吞噬能力，在攝取抗原(包括體外加工)或受到某些因素刺激時(shí)即分化為成熟樹突狀細(xì)胞，而成熟的樹突狀細(xì)胞表達(dá)高水平的共刺激因子和粘附因子。樹突狀細(xì)胞在成熟的過程中，由接觸抗原的外周組織遷移進(jìn)入次級淋巴器官，與T細(xì)胞接觸并激發(fā)免疫應(yīng)答。

T細(xì)胞的有效活化需要兩個(gè)信號的參與，即需要抗原肽-MHC復(fù)合物與TCR-CD 3結(jié)合提供第1信號，以及共刺激分子介導(dǎo)的第2信號。最基本的共刺激信號由抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)的CD80、CD86分子與T細(xì)胞上表達(dá)的相應(yīng)受體提供。

樹突狀細(xì)胞作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的APC，能夠誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成。近年來研究表明,應(yīng)用腫瘤相關(guān)抗原或抗原多肽體外沖擊致敏樹突狀細(xì)胞，回輸或免疫接種于載瘤宿主，可誘發(fā)特異性CTL的抗腫瘤免疫反應(yīng)。