[發明專利]一種高純度D?阿洛酮糖的制備方法

有效

• 申請號: 201611095914.6
• 申請日: 2016-12-02
• 公開（公告）號: CN106520746B
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 張明站;干昭波;竇光鵬;邵先豹;郝梅;杜倩;楊騰騰
• 申請（專利權）人: 山東百龍創園生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12P19/24;C12P19/02
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種高純度D-阿洛酮糖的制備方法，屬于生物技術領域。

背景技術

D-阿洛酮糖是一種重要的稀有糖，在自然界中極少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麥和鼠刺屬植物中。其名稱起源于從抗菌素阿洛酮糖腺苷中也可以分離到少量的D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人體內是通過小腸吸收進入血液循環中，在小腸吸收后不會被代謝成能量，且對于腸道微生物具有較低的發酵利用度。D-阿洛酮糖具有多種重要的生理功能：神經保護作用，將血糖、減脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌細胞增殖，低卡路里甜味劑等。

D-阿洛酮糖可通過提高細胞內谷胱甘肽水平，起到保護神經的作用，降血糖、減脂、改善產品品質、較高的抗氧化功能；作為甜味劑，D-阿洛酮糖甜度相當于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，對生長小鼠幾乎不產生能量，沒有毒性；與果糖和果糖相比，D-阿洛酮糖能抑制小鼠肝臟脂肪合成酶活性，減少腹脂積累，可以作為一種甜味劑在輔助減肥中使用；D-阿洛酮糖顯示出較強的清除活性氧簇的功能，使其在多種疾病預防和治療中顯示出潛在的醫療價值。

中國專利文獻CN105602879A(申請號201610051547.3)公開了一株高效分泌D-阿洛酮糖3-差向異構酶的基因工程菌株及其構建方法。該發明通過利用由瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA來源的D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因rdpe構建重組表達質粒pMA5-RDPE，然后轉化枯草芽孢桿菌，實現了RDPE在枯草芽孢桿菌中組成型分泌表達。通過比較三個糖誘導型啟動子，得到最優誘導型啟動子PxylA，并明顯提高了RDPE的分泌水平。通過敲除木糖利用基因xylAB(xylA和xylB)，阻斷了枯草芽孢桿菌的木糖代謝途徑，進一步提高了RDPE的分泌量，并使誘導劑木糖的最優誘導濃度由4.0％降低為0.5％。最終，采用分批補料方式，在7.5L發酵罐中對工程菌株1A751SD-XR進行評價，RDPE的分泌水平最高可以達到95U/mL和2.6g/L。但該酶的酶活仍然較低，無法滿足實際生產的需要。

但目前D-阿洛酮糖存在轉化率低、易分解等問題，這樣大大限制了D-阿洛酮糖的應用領域，產品本身特性難以有效發揮。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種高純度D-阿洛酮糖的制備方法。

本發明技術方案如下：

一種D-阿洛酮糖的制備方法，步驟如下：

(1)將枯草芽孢桿菌的發酵液經離心后，取菌體經均質處理，得到含有D-阿洛酮糖3-差向異構酶的混合液；

所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BLCY-005，于2016年10月26日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.13152，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；

(2)配制質量濃度為20％～60％的果糖溶液，加入含有D-阿洛酮糖3-差向異構酶的混合液，調pH值5.5～6.5，按質量百分比0.001％～0.005％的比例添加氯化鈷，在40～60℃條件下，保溫反應10～30小時，然后向反應液中流加果糖溶液，維持反應體系中果糖質量濃度為20％～60％，繼續反應10～30h，停止反應，制得D-阿洛酮糖粗液；

(3)將步驟(2)制得的D-阿洛酮糖粗液經脫色、過濾、離交、色譜分離、濃縮后，再經過結晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中，離心條件為：溫度10～20℃，轉速3000r/min，時間30～50分鐘。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中，均質的條件為：溫度10～20℃，壓力30mpa～50mpa，時間10～20min。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中，枯草芽孢桿菌的發酵液的制備方法如下：

I、將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005接種于種子培養基中，在30～38℃的條件下，增殖培養6～12h，制得種子液；

所述種子培養基組分如下，均為重量百分比：

蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化鈉1％，無水硫酸鎂0.01％，磷酸二氫鉀0.02％，余量水，pH6.0～7.0；

II、將步驟I制得的種子液按體積比1～10％的比例接種于發酵培養基中，在30～38℃發酵培養30～48h，制得枯草芽孢桿菌發酵液；

所述發酵培養基組分如下，均為重量百分比：