[發(fā)明專利]microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法

有效

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• 申請日: 2016-12-01
• 公開（公告）號: CN106755348B
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設計）人: 梁好均;王曉靜;宋廷結(jié)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12N15/11;A61K49/00
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發(fā)明涉及分子檢測技術領域，尤其涉及microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法。本發(fā)明提供了用于microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法，該探針組設計合理，利用鏈替換反應使得熒光信號得到級聯(lián)放大，從而實現(xiàn)了對細胞內(nèi)miRNA的檢測。該方法無需嚴格的操作條件，操作簡單，特別是在miRNA分子低表達的細胞或者組織中具有非常好的優(yōu)勢。解決了在之前的檢測技術中存在檢測體系中信號分子輸出中伴隨著目標鏈損失的巨大困難。實驗表明，采用本發(fā)明提供的探針對miRNA進行檢測，能夠使熒光信號在1h左右達到最高，且最大程度避免了熒光信號泄露現(xiàn)象的產(chǎn)生。

技術領域

本發(fā)明涉及分子檢測技術領域，尤其涉及microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約為19-24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。由于miRNA能夠很好的識別并配對后轉(zhuǎn)錄基因進而調(diào)控蛋白的表達，所以它與動物體內(nèi)的生物過程息息相關。目前已經(jīng)有研究表明：miRNA的異常行為會導致疾病的出現(xiàn)，包括心血管疾病，神經(jīng)發(fā)育失常，甚至癌癥[Nature,2012,482,347.]。例如miRNA-32的過表達是前列腺癌的基礎的重要標志物[Oncogene 2012,31,4460.]，miRNA-122也被作為肝癌細胞發(fā)病的一個基礎標志物[J.Am.Chem.Soc.2010,132,7976.]。所以在癌癥的診斷以及治療過程中miRNA的濃度都是一個重要的生物指標。

目前，通用的miRNA檢測方法有qRT-PCR，Northern blot，寡核苷酸微陣列[Chem.Rev.,2013,113,6207.]，其中Northern Blotting是最經(jīng)典的miRNA檢測手段，但是它本身檢測靈敏度較低，并且需要大量的樣品。而微陣列具有高通量檢測的優(yōu)勢，但是檢測需要的時間很長，并且精度不高。qRT-PCR檢測手段具有高精度，高靈敏度的特點，但是需要長時間的擴增步驟并且對操作人員具有一定的技能要求，這在實時檢測中是一個很大的問題。但是上述方法最大的一個問題是所有的實驗都是基于細胞裂解處理，無法實時的反映出腫瘤組織及腫瘤細胞內(nèi)部真實的miRNA的作用機制。

因此為了能更加深入了解miRNA在細胞內(nèi)調(diào)控基因表達的真實信息以及探索miRNA在細胞內(nèi)的反應的動態(tài)過程，實現(xiàn)細胞內(nèi)的miRNA的檢測則尤為重要。現(xiàn)如今體內(nèi)miRNA檢測手段主要分為原位雜交技術和動態(tài)成像技術。在動態(tài)成像技術中基于分子信標成像是一個非常重要的手段。借助特殊的轉(zhuǎn)染技術將熒光標記的分子信標導入細胞內(nèi)，分子信標與目標miRNA分子配對后發(fā)生結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變會導致熒光信號的出現(xiàn)，最終實現(xiàn)miRNA的檢測。[Biomaterials,2012,33,6430.]但是這些技術中存在一個明顯的問題就是每次的信號分子的輸出都伴隨著目標分子的消耗。而在腫瘤細胞或腫瘤組織中的miRNA分子表達非常的有限，所以上述的技術在實現(xiàn)腫瘤組織活細胞內(nèi)miRNA分子的檢測具有很大的限制。

因此，為了克服現(xiàn)有技術中細胞內(nèi)miRNA分子檢測的困難，本發(fā)明人進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)利用級聯(lián)的DNA鏈替換反應實現(xiàn)腫瘤細胞或組織內(nèi)microRNA檢測具有簡單操作，可以實現(xiàn)低濃度檢測等特點，但是，如何避免級聯(lián)DNA鏈替換反應過程中發(fā)生的熒光信號的泄露現(xiàn)象，仍是本領域亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法，本發(fā)明提供的探針設置合理，能夠有效避免熒光信號的泄露，提高檢測的特異性。

本發(fā)明提供的檢測microRNA的探針組，由4條DNA探針組成，分別為：基底鏈、信號鏈、主導燃料鏈和保護燃料鏈；

所述基底鏈包括順序連接的淬滅基團、準粘性末端和待測microRNA的互補序列；

所述信號鏈與基底鏈互補，所述信號鏈一端修飾有熒光基團；

所述保護燃料鏈與待測microRNA互補；