[發明專利]一種DNA聚合酶的固定化方法及其應用

有效

• 申請號: 201611091767.5
• 申請日: 2016-12-01
• 公開（公告）號: CN108130317B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 車團結;徐進章;趙芳
• 申請（專利權）人: 蘇州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N11/02;C12N11/10;C12P19/34
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 張倩倩;李敏

1.一種DNA聚合酶的固定化方法，其特征在于，包括以下步驟：

將4.0～6.0重量份改性殼聚糖加入至160～240體積份水中，加熱溶解，濕熱滅菌，冷卻，得改性殼聚糖水溶液；

將8～12重量份DNA聚合酶加入至所述改性殼聚糖水溶液中，進行吸附反應，得DNA聚合酶的吸附反應液；所述吸附反應的具體條件為：反應溫度為35～40℃，反應的pH值為6.5～7.5，反應時間為100～140min；

將40～60體積份雙醛葡聚糖水溶液加入至所述DNA聚合酶的吸附反應液中，進行交聯反應，然后加入至氯化鉀溶液中，靜置，然后用緩沖液進行洗滌，得DNA聚合酶的交聯反應液；所述交聯反應的具體條件為：反應溫度為30～35℃，反應時間為80～100min；

將所述DNA聚合酶的交聯反應液與木漿海綿進行混合，加入角叉菜膠水溶液，離心，然后用緩沖液進行洗滌，至洗滌液中檢測不出游離的DNA聚合酶；所述緩沖液為含有氯化鈉的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液；

冷凍干燥，即得固定化的DNA聚合酶；所述冷凍干燥的具體條件為：溫度為-20℃～-45℃，壓力為20Pa～100Pa；

所述DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶；

所述改性殼聚糖由以下方法制備而成：在殼聚糖中加入乙酸溶液，攪拌至溶解，然后加入液體石蠟，攪拌；升溫，緩慢加入雙乙酰酒石酸單甘油酯，攪拌；加入甲醛溶液，攪拌；升溫，緩慢滴加NaOH溶液，保持溶液pH值7，再緩慢滴加環氧氯丙烷，攪拌；過濾，先用水洗滌，再依次用石油醚、乙醇、水洗滌，洗滌至洗滌液的pH值為7；加入N,N-二甲基甲酰胺，浸泡；加入三甲胺，在氮氣保護下于攪拌，即得改性殼聚糖。

2.根據權利要求1所述的DNA聚合酶的固定化方法，其特征在于，

所述改性殼聚糖由以下方法制備而成：

在0.4～0.6重量份殼聚糖中加入質量分數為4％～6％的乙酸溶液，攪拌至溶解，然后加入液體石蠟，攪拌5～15分鐘；升溫至38～42℃，緩慢加入雙乙酰酒石酸單甘油酯0.04～0.06重量份，攪拌反應5～15min；加入3.0～7.0體積份的甲醛溶液，攪拌反應1～2小時；升溫至55～65℃，緩慢滴加質量分數為5～15％的NaOH溶液，保持溶液pH值7，再緩慢滴加2.5～4.5體積份的環氧氯丙烷，攪拌反應3～7h；過濾，先用水洗滌，再依次用石油醚、乙醇、水洗滌，洗滌至洗滌液的pH值為7；加入40～60體積份N,N-二甲基甲酰胺，浸泡10～14h；加入0.15～0.35重量份三甲胺，在氮氣保護下于80～100℃下攪拌反應10～14h，即得改性殼聚糖；

所述重量份與體積份的關系為g/mL。

3.根據權利要求1或2所述的DNA聚合酶的固定化方法，其特征在于，包括以下步驟：

將4.0～6.0重量份改性殼聚糖加入至160～240體積份水中，加熱溶解，濕熱滅菌35～55min，冷卻至35～45℃，得改性殼聚糖水溶液；

將8～12重量份DNA聚合酶加入至所述改性殼聚糖水溶液中，進行吸附反應，得DNA聚合酶的吸附反應液；

將40～60體積份的體積分數為0.04％～0.06％的雙醛葡聚糖水溶液加入至所述DNA聚合酶的吸附反應液中，進行交聯反應，然后加入至氯化鉀溶液中，靜置，然后用緩沖液進行洗滌，得DNA聚合酶的交聯反應液；

將所述DNA聚合酶的交聯反應液與木漿海綿進行混合，加入濃度為25～35g/L的角叉菜膠水溶液，離心，然后用緩沖液進行洗滌，至洗滌液中檢測不出游離的DNA聚合酶；

冷凍干燥，即得固定化的DNA聚合酶；

所述重量份與體積份的關系為g/mL。

4.根據權利要求1或2所述的DNA聚合酶的固定化方法，其特征在于，

所述緩沖液為含有0.4～0.6mol/L氯化鈉的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液。