[發明專利]高效獲得大戟轉基因植株的方法及其農桿菌介導轉化體系

有效

• 申請號: 201611088329.3
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106755082B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 蔣繼宏;曹小迎;孟來生;楊緒勤;張方舟;李盼盼
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/38
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 楊曉玲

1.一種高效獲得大戟轉基因植株的方法，其特征是：獲得大戟轉基因植株的方法，具體步驟為：

(1)大戟愈傷組織的誘導：選擇即將開放的或剛開放的花為愈傷組織誘導用外植體，進行消毒，程序如下：先用自來水沖洗2h，無菌水沖洗2次，75％乙醇消毒45s，無菌水沖洗3次，0.1％升汞消毒6min；在愈傷組織誘導培養基上進行培養，在花的切口處逐漸產生白色的愈傷組織，并且花骨朵不斷膨大；

所述愈傷組織誘導培養基為：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+植物 凝膠0.4g/L；

(2)大戟胚性愈傷組織的誘導培養：將大戟花骨朵誘導出的白色愈傷組織轉接至胚性愈傷誘導培養基上，預防水樣化和褐化，并獲得致密的、硬度增加的胚性愈傷組織；

所述胚性愈傷誘導培養基為：MS+6-BA 2.0mg/L+ NAA 0.1mg/L+蔗糖 30g/L+0.4g/L植物凝膠；

(3)遺傳轉化：利用根癌農桿菌介導法，將含潮霉素基因的植物表達載體pCAMBIA1301轉化根癌農桿菌，以大戟胚性愈傷組織為受體進行轉化；

(4)抗性胚性愈傷組織的脫菌、篩選和增殖培養：愈傷組織轉接到恢復培養基上，進行脫菌培養，恢復培養基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖 30g/L+4g/L植物凝膠+300mg/L cef，于26±1℃暗培養2個星期后轉 接到篩選培養基上進行抗性愈傷組織的篩選培養，每4個星期繼代培養一次，篩選培養基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+4g/L植物凝膠+300mg/L cef +100mg/L潮霉素；

(5)抗性愈傷組織的分化培養：將抗性愈傷組織轉入到分化培養基上培養，待分化出芽后，將長出的小芽轉入到不含潮霉素的分化培養基中，待小苗長壯后生根；所述的分化培養基為：MS+6-BA 3.0mg/L+ NAA 0.05mg/L+蔗糖 30g/L+4g/L植物凝膠+cef 250mg/L+潮霉素100mg/L；

(6)PCR(聚合酶鏈反應)法檢測轉基因植株：提取每個植株的總DNA,PCR檢測是否含有潮霉素磷酸轉移酶基因；如果電泳能檢測出目的條帶，表明外源基因整合到受體細胞的染色體中并表達。