[發明專利]一種凍存液及其應用與凍存脂肪組織的方法

在審

• 申請號: 201611087952.7
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106719602A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 陳海佳;葛嘯虎;王一飛;黃幸;王小燕
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明涉及細胞技術領域，尤其涉及一種凍存液及其應用與凍存脂肪組織的方法。

背景技術

脂肪組織(adipose tissue)：主要由大量群集的脂肪細胞構成，聚集成團的脂肪細胞由薄層疏松結締組織分隔成小葉。脂肪組織中的網狀纖維很發達。黃(白)色脂肪組織呈黃色(在某些哺乳動物呈白色)，即通常所說的脂肪組織。它由大量單泡脂肪細胞集聚而成，脂肪細胞呈圓形或多邊形，細胞中央有一大脂滴，胞質呈薄層，位于細胞周緣，包繞脂滴。在HE切片上，脂滴被溶解成一大空泡。胞核扁圓形，被脂滴推擠到細胞一側，連同部分胞質呈新月形。黃色脂肪組織主要分布在皮下組織、網膜和腸系膜等處，在成年男子一般約占體重的10％～20％，女人往往更多一些。脂肪組織是人體內最大的“能源庫”。具有貯存脂肪、保持體溫和參與脂肪代謝的功能。參與能量代謝，并具有產生熱量、維持體溫、緩沖保護和支持填充等作用。

自體脂肪是一種理想的填充材料，幾乎可用于全身各個部位的軟組織缺損填充。盡管為了提高成活率和減少吸收率，國內外的研究人員進行了大量的研究，但目前移植后脂肪組織體積最終只能保持在移植時的50％左右。因此，臨床上仍需要通過少量、反復、多次移植提高脂肪移植成活率，以達到患者滿意的填充效果。但多次脂肪注射除增加了醫生的工作量外，對患者造成多次抽脂的痛苦、較高的風險及費用。如果能實現一次抽取足夠的脂肪體外長期冷凍儲存，需要時復溫培養后注射移植，則具有重要的臨床應用價值。

目前尚未有專們用于脂肪組織凍存的方法，經典的凍存液配方是FBS+DMSO，主要用在細胞凍存上，但該凍存液對脂肪組織的保存效果并不穩定。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種凍存液及其應用與凍存脂肪組織的方法，以本發明提供的凍存液凍存脂肪組織，能夠保護脂肪組織的活性，經復融后脂肪組織中的細胞仍保持良好的分化能力。

本發明提供的凍存液包括：基礎培養液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇。

非必需氨基酸(non-essentialaminoacid，NEAA)，包含7種細胞培養所需非必需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、羥脯氨酸。非必需氨基酸的添加能夠增加細胞的繁殖力，延長細胞的生存時間。NEAA可為自行配置也可為市場購得，本發明對此不做限定，其實施皆在本發明的保護范圍之內。本發明采用的NEAA為購自sigma的100×NEAA。本發明中，NEAA的體積分數為1％。

DMSO：二甲基亞砜，是一種含硫有機化合物，分子式為(CH₃)₂SO，常溫下為無色無臭的透明液體，是一種吸濕性的可燃液體。DMSO能快速通過細胞膜進入細胞內部，在細胞冷凍過程中，維持細胞內外的水和離子平衡，本發明實施例中，DMSO的體積分數為10％～20％；一個具體實施例中，DMSO的體積分數為20％。

丙三醇為無色味甜澄明黏稠液體。無臭，有暖甜味，俗稱甘油。具有保護細胞活性的作用。本發明實施例中，丙三醇的體積分數為5％～30％。一個具體實施例中，丙三醇的體積分數為15％。

1,2-丙二醇的化學式為C₃H₈O₂；其可與水、乙醇及多種有機溶劑混溶，具有保護細胞活性的作用。本發明實施例中，1,2-丙二醇的體積分數為5％～30％。一個具體實施例中，1,2-丙二醇的體積分數為15％。

本發明實施例中，基礎培養液DMEM/F12。

本發明所用的基礎培養液可為自制也可為購買獲得，本發明對此不做限定，其實施皆在本發明的保護范圍之內。本發明實施例中，基礎培養基為DMEM/F12。

一些具體實施例中，本發明提供的凍存液包括：

一個具體實施例中，本發明提供的凍存液包括：

一個具體實施例中，本發明提供的凍存液包括：

一個具體實施例中，本發明提供的凍存液包括：

本發明提供的凍存液在脂肪組織凍存中的應用。

本發明實施例中，以本發明提供的凍存液凍存脂肪組織，3個月后復蘇并進行原代分離培養，結果表明，復蘇后的脂肪組織原代分離獲得脂肪干細胞的成功率為100％。培養至第三代后，誘導脂肪干細胞向脂肪細胞分化。

本發明還提供了一種凍存脂肪組織的方法，以本發明提供的凍存液與脂肪組織混合后，浸入液氮中。