[發明專利]一種改造芽孢桿菌基因組的方法

有效

• 申請號: 201611081187.8
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106755046B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 任鈞;唐旭;曹鏡;雷蕾;樊超;柴進凱;曹富明;孫楠;范佳
• 申請（專利權）人: 成都美溢德生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/74;C12R1/125;C12R1/10;C12R1/07;C12R1/46;C12R1/01
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 易小藝

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種改造芽孢桿菌基因組的方法。本發明具有適應性廣(質粒轉化難度低，pBTS質粒可以在多種革蘭氏陽性菌中進行復制，改造多種菌的基因組)，可以反復多次改造同一菌株(重組質粒具有兩個同源重組片段，依次發生兩次同源重組，第二次同源重組后可能恢復到野生型，也可以得到改造菌株，但是不殘留任何影響繼續改造的片段，如抗性標記、質粒復制元件等)，并且可以改造對細菌生長影響較大的基因(引入cre重組酶和第二種抗性標記系統，可依靠抗性篩選第二次重組得到的改造菌株，殺死生存能力強的野生型菌株，之后表達cre重組酶，切割掉第二種抗性標記，殘留的片段不會影響再次對菌株進行改造)。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種改造芽孢桿菌基因組的方法。

背景技術

蛋白表達技術是現代生物學的核心技術之一，表達蛋白不僅可用于生物學研究，也可以提供商業化的蛋白制品，如重組疫苗、重組胰島素、細胞因子等產品。目前常用的表達系統有大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等，但是它們都各有明顯的優缺點。大腸桿菌表達系統研究最充分，有多種選擇，最常用的是Novagen的pET表達系統，其利用噬菌體的T7RNA聚合酶可專一性地轉錄T7啟動子后的目的基因。在最佳條件下，目的蛋白可以達到大腸桿菌總蛋白的50％以上。盡管具有表達效率高，培養成本低等優點，但是缺點也非常明顯：蛋白容易形成包涵體，復性難度和成本較高；大腸桿菌不能對蛋白進行糖基化修飾；細胞壁含有脂多糖(內毒素)，不易完全去除。另外一個常用的表達系統是酵母表達系統，其具有表達量高，可誘導，蛋白分泌到胞外易于純化，并且具有一定的翻譯后修飾能力等優點，但是缺點是部分表達產物易降解，表達量不可控，大于30KDa的蛋白幾乎不能分泌。動物細胞和昆蟲細胞表達系統的特點是具有完整的修飾系統，表達產物具有或者類似的天然活性，沒有內毒素污染，但是表達量低，周期長，技術要求高，生產成本高。

枯草芽孢桿菌是一種廣泛存在于水體、空氣、土壤中的革蘭氏陽性菌，其可以在環境不適宜的時候產生孢子，孢子可以抵御高溫、干旱等極端環境，待環境適宜時再萌發進行營養生長。枯草芽孢桿菌的分泌能力強，在進行高密度發酵時，蛋白分泌量可以達到20—25g/L。其發酵生產的蛋白酶、淀粉酶、次黃嘌呤核苷、核糖甙等產品，早已經進入我們的日常生活。由于其具有生物安全性，被FDA評委GRAS類添加劑，其生產的益生菌及利用其生產的發酵產品已廣泛應用于醫藥和養殖業中。

上世紀八十年代就開始利用枯草芽孢桿菌進行蛋白表達，其表達產物不僅包括細菌來源的各種酶類，如淀粉酶、蛋白酶、內葡聚糖酶、脂肪酶等，還包括hEGF、IFN-alpha 2、Proinsulin、Streptavidin、cathelicidin-BF等不同來源的蛋白。利用枯草芽孢桿菌的分泌途徑，可將表達蛋白分泌到發酵液中，極大地降低了后期分離純化的難度。枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，不含有脂多糖，便于生產注射用藥品。枯草芽孢桿菌的營養要求簡單，由于其已經實現規模工業化生產，大規模培養技術難度低，培養成本低。目前，枯草芽孢桿菌中的多個菌株及芽孢桿菌屬中的多個種都已經完成了基因組測序工作，遺傳背景清楚，安全性高，也便于進行基因組改造。但是枯草芽孢桿菌表達系統并不是一個廣泛應用的表達系統，還有許多缺點待克服。