[發(fā)明專利]一種實(shí)蠅幼蟲檢疫處理的代謝組學(xué)判別方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611079689.7
• 申請(qǐng)日: 2016-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN106596804B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任荔荔;劉波;魯敏;周烔;段勝亮;詹國(guó)平;王躍進(jìn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N30/06
• 分類號(hào): G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 11212 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 楊立

1.一種實(shí)蠅幼蟲檢疫處理的代謝組學(xué)判別方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：對(duì)待檢疫的實(shí)蠅幼蟲樣品進(jìn)行代謝組學(xué)前操作，并將得到的實(shí)蠅幼蟲樣品進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，包括以下步驟：

S1.1：提取總代謝物，得到總代謝物提取液，具體步驟為：

取-80℃儲(chǔ)存的10頭3齡的實(shí)蠅幼蟲加入到200μL的提取液中，所述提取液為氯仿、甲醇和水組成，所述提取液中氯仿、甲醇和水的體積比為2:5:2，將所述實(shí)蠅幼蟲和所述提取液的混合物置入組織破碎儀后得到破碎混合物，所述組織破碎儀的頻率為30Hz，所述組織破碎儀運(yùn)行時(shí)間為2min；將所述破碎混合物取出，加入800μL所述提取液，渦漩震蕩30s，之后4℃放置20min，得到震蕩后混合物；將所述震蕩后混合物進(jìn)行第一次冷凍離心，所述第一次冷凍離心的溫度為4℃，所述第一次冷凍離心的力度為16000g，所述第一次冷凍離心時(shí)間為15min，經(jīng)過所述第一次冷凍離心后得到第一上清液和第一殘?jiān)?00μL所述第一上清液轉(zhuǎn)入一只新的EP管中；向所述第一殘?jiān)屑尤?mL色譜級(jí)甲醇，渦漩震蕩30s，之后4℃放置20min，再進(jìn)行第二次冷凍離心，所述第二次冷凍離心的溫度為4℃，所述第二次冷凍離心力度為16000g，所述第二次冷凍離心的時(shí)間為15min，所述第二次冷凍離心后得到第二上清液和第二殘?jiān)∷龅诙锨逡?mL，將所述第二上清液與所述第一上清液混合得到上清混合物；

S1.2：向所述總代謝物提取液中添加內(nèi)標(biāo)，具體步驟為：

取100μL所述上清混合物加入到玻璃衍生小瓶中，再加入20μl 100 ng/μL內(nèi)標(biāo)水溶液，混合，氮?dú)獯蹈桑?/p>

S1.3：吹干，加入甲基化試劑進(jìn)行甲基化，具體步驟為：

再向所述玻璃衍生小瓶中加入40μL的20 mg/mL鹽酸甲氧胺吡啶溶液，37℃下震蕩反應(yīng)90min；

S1.4：加入烷基化試劑進(jìn)行烷基化，具體步驟為：

再向所述玻璃衍生小瓶中加入40μL的BSTFA的衍生試劑，BSTFA含1%TMCS，70℃下反應(yīng)60min，得到衍生后樣本，將所述衍生后樣本室溫放置30min，得到待檢測(cè)樣本；

S1.5：進(jìn)行GC/MS檢測(cè)，具體步驟為：

將所述待檢測(cè)樣本進(jìn)行GC/MS檢測(cè)，所用毛細(xì)管色譜柱為HP-5ms色譜柱，色譜柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑為0.25mm，膜厚0.25μm，在所述GC/MS檢測(cè)過程中：進(jìn)樣口溫度為280℃，EI離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，高純氦氣作為載氣，所述高純氦氣的純度大于99.999%，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1.0μL；升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，初始溫度維持2min，再以10℃/min的速度升至140℃，然后以4℃/min的速度升至240℃，最后以15℃/min的速度升至300℃，并維持8min；采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)范圍為50-600m/z；采用隨機(jī)順序進(jìn)行連續(xù)樣本分析，避免因儀器信號(hào)波動(dòng)而造成的影響，得到檢測(cè)數(shù)據(jù)；

S2：將S1得到的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，得到樣品數(shù)據(jù)；

S3：將S2得到的樣品數(shù)據(jù)與陰性對(duì)照數(shù)據(jù)和陽性對(duì)照數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，如果所述樣品數(shù)據(jù)與所述陽性對(duì)照數(shù)據(jù)的比較結(jié)果為無顯著差異，并且與所述陰性對(duì)照數(shù)據(jù)的比較結(jié)果為差異顯著，則判定所述待檢疫的實(shí)蠅幼蟲進(jìn)行了檢疫處理；否則，判定所述待檢疫的實(shí)蠅幼蟲未進(jìn)行檢疫處理。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S2中得到樣品數(shù)據(jù)包含以下數(shù)據(jù)：保留時(shí)間、質(zhì)荷比、觀察量和積分面積。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述陰性對(duì)照數(shù)據(jù)為從正常生長(zhǎng)的實(shí)蠅幼蟲得到的代謝組學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)，并且所述陽性對(duì)照數(shù)據(jù)為從檢疫處理的實(shí)蠅幼蟲得到的代謝組學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，S3中所述統(tǒng)計(jì)學(xué)比較為主成分分析、偏最小二乘方-判別分析和正交偏最小二乘方-判別分析。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在所述偏最小二乘方-判別分析和正交偏最小二乘方-判別分析中還使用R²Y值和Q²值判定分析結(jié)果的置信度，當(dāng)R²Y值和Q²值均大于0.5時(shí)，認(rèn)為該判定可信。