[發明專利]2-甲基丁酸側鏈水解酶和產莫納可林J的曲霉菌株及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201611079430.2
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN108118042B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 呂雪峰;黃雪年;楊勇;鄭玲輝;黃雋;滕云;應玲萍
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所;浙江海正藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N1/15;C12P17/06;C12P7/42;C12R1/66
• 代理公司: 北京信諾創成知識產權代理有限公司 11728
• 代理人: 陳悅軍

本發明屬于生物制藥技術領域，涉及一種2?甲基丁酸側鏈水解酶和能夠合成該水解酶從而生產莫納可林J的菌株。本發明提供的2?甲基丁酸側鏈水解酶能夠有效水解洛伐他汀為莫納可林J，酶活性高，從而簡化了辛伐他汀的生產工藝，降低成本，提高生產效率，減少環境污染。

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，涉及一種2-甲基丁酸側鏈水解酶及其應用；更進一步地，涉及莫納可林J的生產。

背景技術

心腦血管疾病嚴重威脅人類健康，其發病率和死亡率在許多國家和地區排名第一。高脂血癥(高膽固醇血癥)是心腦血管疾病的一個重要誘因，因此預防高脂血癥、調節血脂和降低血脂成為防治心腦血管疾病的關鍵。基于上述原因，降膽固醇藥物具有很大的市場前景，多年來一直位于全球暢銷藥物的前列。

辛伐他汀(Simvastatin)即舒降之(Zocor)，是Merck公司研發的一種重要的降血脂藥物，能有效地抑制膽固醇的體內合成，是治療高脂血癥的首選藥物之一。隨著2006年專利到期，辛伐他汀的市場競爭日益激烈，其工藝技術研究和生產成本成為產品競爭的重要因素。辛伐他汀并非天然化合物，而是以土曲霉的發酵產物洛伐他汀(lovastatin)為原料通過化學合成的。辛伐他汀和洛伐他汀的區別僅在于側鏈多一個甲基，辛伐他汀為2,2-二甲基丁酸側鏈，洛伐他汀為2-甲基丁酸側鏈。在辛伐他汀的合成過程中，需要先去除洛伐他汀C8位的2-甲基丁酸側鏈，獲得莫納可林J(Monacolin J)，然后再通過后續工藝將2,2-二甲基丁酸側鏈添加到莫納可林J的C8位上，從而獲得辛伐他汀。由此可見，莫納可林J是辛伐他汀合成的重要前體物。目前，辛伐他汀的合成路線中，采用化學方法水解洛伐他汀制備莫納可林J，整個制備過程中會使用到大量的酸、堿，以及二氯甲烷、甲苯和乙醚等有機試劑，工藝復雜、耗時長、收率低、污染壓力大。基因工程改造是一種有效的遺傳育種技術。如果能夠通過基因工程改造方法對產洛伐他汀土曲霉進行遺傳改造，使之能夠直接發酵生產莫納可林J，那么就可以簡化辛伐他汀的合成工藝，降低生產成本，同時還可以減少環境污染，從而提高產品的市場競爭力。

因此，如果能找到一種簡單高效、環境友好的莫納可林J生產方法，不僅會簡化辛伐他汀的合成工藝，降低生產成本，還可以減少環境污染，從而提高產品的市場競爭力。同時，酶法是一種綠色高效的生物催化方法，自然界中也存在一些微生物能水解掉洛伐他汀的側鏈，因此也可以基于這類酶開發出莫納可林J的酶法生產工藝。在制備辛伐他汀的專利申請(WO2005040107A2)中公布了一種能水解洛伐他汀側鏈的β-內酯酶及用其制備莫納可林J的方法。但是，這種水解酶的活性偏低。此外，由于洛伐他汀和辛伐他汀的結構相似，在工藝上很難分離，使得洛伐他汀殘留成為辛伐他汀生產的一個棘手問題。

發明內容

本發明通過提供一種能夠產莫納可林J的曲霉菌株而解決現有技術中存在的技術問題。

在一個方面，本發明提供一種生物材料，為

(1)一種蛋白質，為2-甲基丁酸側鏈水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)一種核酸分子，其編碼氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白質；優選地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO:2所示；或

(3)包含(2)所述的核酸分子的表達盒、重組載體、重組細胞或重組微生物。

在第二個方面，本發明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白質在水解含有2-甲基丁酸側鏈的他汀類物質中的應用；優選地，所述含有2-甲基丁酸側鏈的他汀類物質為洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀；進一步優選地，所述洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀為酸式、內酯式或鹽式。

在第三個方面，本發明提供一株產莫納可林J的曲霉菌株，其能夠生產氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白質。