[發(fā)明專利]一種特異性抗Kif4A蛋白1161位蘇氨酸磷酸化抗體的制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611079249.1
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN108117590A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱長軍;董智雄;姜偉
• 申請（專利權(quán)）人: 天津師范大學(xué)
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 天津創(chuàng)智天誠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 12214
• 代理人: 王秀奎

本發(fā)明公開了一種特異性抗Kif4A蛋白1161位蘇氨酸磷酸化抗體的制備方法與應(yīng)用，特異性抗Kif4A蛋白T1161磷酸化抗體對深入研究其磷酸化狀態(tài)對Kif4自身功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)以及對整個細胞有絲分裂過程的影響具有重要意義，該抗體制備及應(yīng)用為揭示Kif4分子的磷酸化狀態(tài)在細胞周期有絲分裂過程中的基本調(diào)節(jié)機制，初步分析其與癌癥發(fā)生的關(guān)系，對深刻理解細胞有絲分裂的基本規(guī)律，以及基于Kif4分子靶點的腫瘤防治策略的設(shè)計提供了研究基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)應(yīng)用，尤其涉及一種特異性抗Kif4A蛋白1161位蘇氨酸磷酸化抗體的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

驅(qū)動蛋白分子的研究是近幾年生命科學(xué)領(lǐng)域的又一熱點。對其功能的揭示不僅有助于深入理解正常細胞生長、組織發(fā)育及器官功能，也可為許多疾病發(fā)生發(fā)展基本機制的揭示提供新思路。染色體驅(qū)動蛋白分子Kif4A在細胞有絲分裂期，定位于染色體和紡錘體，參與染色質(zhì)凝集、染色體分離、紡錘體形成和胞質(zhì)分裂過程。因此對于特異性抗Kif4A蛋白T1161磷酸化抗體對深入研究其磷酸化狀態(tài)對Kif4自身功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)以及對整個細胞有絲分裂過程的影響具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供了一種特異性抗Kif4A蛋白1161位蘇氨酸磷酸化抗體的制備方法與應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種Kif4A-T1161磷酸化多肽，具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列Ser-Phe-Phe-Asn-Pro-Val-Cys-Ala-Thr-Pro-Asn-Ser-Lys-Ile-Leu-Lys-Flu-Met-Cys，其中蘇氨酸進行磷酸化，即外帶一個磷酸根。

一種Kif4A-T1161磷酸化抗原，由所述的Kif4A-T1161磷酸化多肽與血藍蛋白KLH交聯(lián)制備形成，按照下列具體步驟進行：

(1)將G-25交聯(lián)葡聚糖800rpm,5min離心,棄上清，加入與葡聚糖等體積的PBS緩沖液混勻；

(2)向25ml玻璃瓶中加入134微升KLH，1866微升pH為6.0的PBS，最終KLH終濃度為10mg/ml；

(3)稱0.006g MBS，溶于200微升DMSO；

(4)在攪拌情況下，將步驟(3)的MBS分散體系緩慢加入到步驟(2)的KLH分散體系中，采用移液槍槍頭尖伸至液面以下的方式進行緩慢加入，持續(xù)攪拌30min；

(5)取一個25ml塑料移液管(作為層析柱)，用剪刀剪去上口，玻璃纖維堵住下口，將步驟(1)中G25交聯(lián)葡聚糖充分混勻倒入管子，純葡聚糖約5-6ml，使用50ml pH為7.4的PBS清洗蛋白親和層析柱；

(6)將步驟(4)中經(jīng)攪拌分散均勻的KLH-MBS混合液加入步驟(5)準備的柱子；

(7)待KLH-MBS混合液全部進入柱子后，用pH 7.4PBS洗1次，同時開始用1.5ml的EP管在下面接液體，每管1ml，應(yīng)用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，選濃度最高的3管液體進行混合，用于下述多肽交聯(lián)；

(8)將10mg多肽(SEQ ID No.1所述的氨基酸序列：Ser-Phe-Phe-Asn-Pro-Val-Cys-Ala-Thr-Pro-Asn-Ser-Lys-Ile-Leu-Lys-Flu-Met-Cys)加入200微升pH 7.4PBS溶解，將溶解的多肽加入1.5ml經(jīng)過步驟(7)得到的KLH混合物，攪拌1h；

(9)將經(jīng)過步驟(8)交聯(lián)的物質(zhì)用pH 7.4PBS透析12小時，每12h更換透析液(pH7.4PBS)，每次800ml；取出透析后的液體，加入pH 7.4PBS至總體積10ml，每管1ml分裝，-80度凍存。