[發明專利]CD146單克隆抗體在膠質瘤血管周細胞檢測及分離鑒定中的應用

有效

• 申請號: 201611078356.2
• 申請日: 2016-11-29
• 公開（公告）號: CN106589124B
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 張曉寧;易維京;時雨;平軼芳;卞修武;蔡瑞麗;廖嘉明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N5/20;C12N5/09;G01N33/577;G01N33/569;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 重慶志合專利事務所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

一種CD146單克隆抗體在膠質瘤血管周細胞檢測及分離鑒定中的應用，其CD146單克隆抗體由保藏號為CCTCC NO：C2016183的雜交瘤細胞株制備。本發明方法所述CD146單克隆抗體4F10具有良好的特異性，能夠準確識別腫瘤血管周細胞，并且CD146單克隆抗體4F10可用于膠質瘤源性周細胞的流式細胞分選和檢測。

技術領域

本發明涉及惡性膠質瘤微環境及抗血管治療策略，以及更具體地涉及CD146單克隆抗體在膠質瘤血管周細胞檢測及分離鑒定中的應用。

背景技術

惡性膠質瘤是中樞神經系統常見的原發性腫瘤，惡性程度極高，患者生存期短、復發率高、治療困難。豐富的腫瘤新生血管是惡性膠質瘤的重要結構特征，也是導致腫瘤增殖侵襲的重要原因。周細胞是毛細血管及微血管的重要組成部分，被血管基底膜包繞，并與內皮細胞有直接接觸，在穩定血管機械結構、維持內皮細胞生理學功能方面發揮重要作用。國內外的前期研究發現，膠質瘤血管周細胞大量富集且存在高度異型性。課題組最新研究發現，80％-90％的膠質瘤血管周細胞由膠質瘤干細胞轉分化而來。但目前由于缺乏有效針對腫瘤血管周細胞分選和富集的方法，惡性膠質瘤中血管周細胞的表型特征及臨床病理學意義尚未闡明。因此，研發特異性識別腫瘤血管周細胞的技術方法，將為進一步認識惡性膠質瘤腫瘤血管周細胞發生機理、明確其功能表型及制定靶向治療策略提供重要支撐。

CD146是一種單鏈膜貫通性糖蛋白,屬免疫球蛋白超家族成員,與許多細胞黏附分子有同源性。已有報道表明，CD146是正常組織中血管周細胞的標記分子之一，能特異性識別惡性膠質瘤中的血管周細胞；但針對腫瘤源性血管周細胞上CD146抗原表位的特異性識別抗體未見報道。

發明內容

針對上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供CD146單克隆抗體在膠質瘤血管周細胞檢測及分離鑒定中的應用，制備針對CD146的特異性抗體并評價該抗體在分選富集膠質瘤源性血管周細胞及其表型鑒定中的效果。

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種CD146單克隆抗體，其特征在于由保藏號為CCTCC NO:C2016183的雜交瘤細胞株制備。

所述CD146單克隆抗體為4F10。

上述CD146單克隆抗體的制備方法，包含以下步驟：

1)免疫原準備；

2)免疫原免疫Balb/c小鼠；

3)被免疫Balb/c小鼠血清效價測定；

4)脾臟B淋巴細胞和SP2/0細胞懸液的制備；

5)飼養細胞的制備；

6)骨髓瘤細胞和脾臟B淋巴細胞融合；

7)特異性雜交瘤細胞的篩選；

8)CD146單克隆抗體腹水制備；

9)CD146單克隆抗體亞類的鑒定；

10)腹水中純化CD146單克隆抗體；

11)ELISA鑒定CD146單克隆抗體的特異性。

進一步地，步驟1)包括：采用真核表達的CD146蛋白作為免疫原(Met1-Gly559)，真核表達的CD146蛋白為人工程細胞表達的CD146蛋白(購自北京神州義翹，貨號：10115-H08H，)。

進一步地，步驟2)包括對Balb/c小鼠進行首次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加強免疫，其中首次免疫將CD146蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化混合做免疫原，第二次免疫和第三次免疫分別將CD146蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化混合做免疫原，加強免疫將CD146蛋白做免疫原，各免疫原的量、注射體積和途徑不變。