[發明專利]白三葉的組織培養及快速繁殖方法

有效

• 申請號: 201611076580.8
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106718886B
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發明（設計）人: 姜華;何承剛;畢玉芬;辛培堯;段新慧;單貴蓮;韓博;羅富成;趙雁;馬向麗
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙) 53108
• 代理人: 馬曉青

1.白三葉的組培繁殖方法，該方法包括取白三葉的種子進行消毒、選取外植體、誘導分化、壯苗、生根培養、移栽步驟，其中誘導分化培養基為MS+B₅4.4g/L+BAP l.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖40g/L+瓊脂8.0g/L+Timentin 300mg/L+Cefotaxime 300mg/L；壯苗培養基為MS+B₅4.4g/L+BAP 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖40g/L+瓊脂8.0g/L+Timentin 300mg/L+Cefotaxime 300mg/L；生根培養基為MS+B₅ 4.4g/L+蔗糖40g/L+瓊脂8.0g/L；

所述的消毒和選取外植體步驟是將白三葉種子放入到15ml的離心管里，用70％酒精浸泡1min，用5％次氯酸鈉浸泡5min，無菌水沖洗4遍，用無菌水浸泡在17℃下過夜，在超凈工作臺上、實物顯微鏡下，切去胚根，保留子葉及基部2-3mm，剝去外種皮，沿兩片子葉內側縱劈胚軸作為外植體；

所述的誘導分化、壯苗、生根培養、移栽步驟是將切好的帶有2-3mm胚軸的子葉放入上面帶有滅菌濾紙的誘導分化培養基MS+B₅4.4g/L+BAP l.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖40g/L+瓊脂8.0g/L+Timentin 300mg/L+Cefotaxime 300mg/L上，培養條件為溫度26℃，光照16h，光照強度2000Lx，培養3天后，將綠色的子葉分散放入到無濾紙的誘導分化培養基上，相同的培養條件，培養14天后，將帶有叢生芽的子葉再次轉入到新的誘導分化培養基上，相同的培養條件培養14天；然后把培養的叢生芽上黃色老的子葉切除后，將綠色的叢生芽轉入壯苗培養基MS+B₅4.4g/L+BAP 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖40g/L+瓊脂8.0g/L+Timentin300mg/L+Cefotaxime 300mg/L上，培養條件為溫度26℃，光照18h，光照強度2000Lx，培養14天；將生成3～4cm高的無根小苗分割開，移入生根培養基MS+B₅ 4.4g/L+蔗糖40g/L+瓊脂8.0g/L上，培養條件為溫度26℃，光照18h，光照強度2000Lx，培養20天，當試管苗出現3-5條粗根，根長3-5cm，苗高5cm以上時移栽，先打開封瓶膜，經3～5天鍛煉，移入混有滅過菌的營養土即園土:腐殖土:砂土＝2:2:1和適量珍珠巖的培養盤內，最初7天用塑料薄膜覆蓋，遮陽保濕，使環境相對濕度保持在80％，并早晚通氣半小時，成活后去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。