[發明專利]一種Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA基因突變的檢測引物、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201611076186.4
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106755335B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 張清炯;賈小云;黎仕強;郭向明;肖學珊
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發明涉及一種Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA基因突變的檢測引物、試劑盒和檢測方法。本發明基于Sanger測序的原理，具有高度的敏感性、穩定性和準確性的特點，可以同時檢測LHON mtDNA最常見的四個致病突變，解決了現有檢測LHON線粒體DNA突變方法的靈敏度低和特異性不夠強、容易污染和費用昂貴等問題，為LHON提供了一種精準的基因診斷方法，對該病的遺傳咨詢和基因治療有重要意義。

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA基因突變的檢測引物、試劑盒和檢測方法。

背景技術：

Leber遺傳性視神經病變(Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON)是最常見的線粒體遺傳病之一，也是青壯年視力喪失的最常見原因之一[Man PYW et al.J MedGenet,2002]。95％以上的患者是由線粒體DNA(mtDNA)的3個原發致病突變引起，包括位于MT-ND4基因的m.11778GA，MT-ND6基因的m.14484TC以及MT-ND1基因的m.3460GA[Cerelli V et al.Prog Retin Eye Res,2004]。而位于MT-ND1基因的m.3635GA突變是中國人群中第4個常見突變，其突變頻率與m.3460GA突變相當[Jia XY et al.J Hum Genet,2006]。通過對這4個位點進行突變檢測，對于這種嚴重影響青壯年視力疾病的早期診斷、干預、和治療具有重要意義。

目前，一方面，市場上沒有商品化的LHON常見mtDNA 4位點突變檢測試劑盒；另一方面，LHON的基因診斷最常見的方法有等位基因特異性PCR(AS-PCR)[CN1288254C,CN102146443A，CN101781683A]、限制性片段長度多態性(RFLP)[CN1143117A，CN102747152A，CN104774927A，CN103173545A，CN104774926A，CN103173544A]以及等位基因特異性熒光探針技術PCR[CN1721839A,CN1712543A]，檢測單個或者3個常見突變位點，這些檢測方法都具有簡便、快速、費用低的優點，但是由于mtDNA變異在人群中發生頻率高，位于原發突變鄰近區域的變異會影響結果，造成假陽性或假陰性，此外，還有芯片檢測法[CN101497925A,CN104805210A]，可以同時檢測更多LHON相關mtDNA變異，具有準確高通量的優點，但是該方法費用昂貴。

發明內容：

本發明的目的是提供一種具有高度的敏感性、穩定性和準確性的Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA基因突變的檢測引物、試劑盒和檢測方法。

本發明的第一個目的是提供Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA基因突變的檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

MT-ND4-F：5’-GCCTACCCCTTCCTTGTACT-3’(如SEQ ID NO.1所示)，MT-ND4-R：5’-TGGTTACTAGCACAGAGAGTTCT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；MT-ND6-F：5’-GTTTACCACAACCACCACCC-3’(如SEQ ID NO.3所示)，MT-ND6-R：5’-AAGCCTTCTCCTATTTATGGGG-3’(如SEQ ID NO.4所示)；MT-ND1-F：5’-GGCCAACCTCCTACTCCTC-3’(如SEQ ID NO.5所示)，MT-ND1-R：5’-TGATGGCTAGGGTGACTTCA-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

本發明的第二個目的是提供Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，包括上述的檢測引物。

優選，所述的檢測試劑盒還包括2*Master Mix、ddH₂O、陽性質控品和陰性質控品。