[發(fā)明專利]一種豬源大腸桿菌的分離鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611074505.8
• 申請(qǐng)日: 2016-11-29
• 公開（公告）號(hào): CN106755274B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董發(fā)明;張炳亮;白喜婷;梁立欽;王文文;楊國棟;邱妍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/10
• 分類號(hào): C12Q1/10;C12N1/02;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 胡云飛

本發(fā)明公開了一種豬源大腸桿菌的分離鑒定方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法主要包括細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色及鏡檢和生化鑒定試驗(yàn)三步操作，方法簡單、耗時(shí)短，成本低，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。其中細(xì)菌分離培養(yǎng)依次采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，生長出的菌落形態(tài)清晰，便于挑取分離。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬源大腸桿菌的分離鑒定方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

大腸桿菌是一類廣泛存在于自然界并能引起人和動(dòng)物共同感染的人畜共患病病原，依其致病機(jī)制可分為3類：共生型、腸內(nèi)致病型和腸外致病型。大腸桿菌病主要是由病原大腸埃希氏菌引起的一種急性、多形性、腸道型傳染病。在獸醫(yī)臨床上，由于病源性大腸桿菌的血清型、免疫狀態(tài)、生理機(jī)能以及豬的日齡等存在差異，常見的豬大腸桿菌病分為3種，即3日齡仔豬黃痢、7～10日齡仔豬白痢和30日齡仔豬水腫病。豬大腸桿菌病在世界各地均有發(fā)生，而仔豬黃、白痢是豬場(chǎng)中最為常見的傳染病，其發(fā)病率、死亡率均居仔豬疫病之首，已給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大危害和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌病發(fā)生后多采用抗生素類藥物進(jìn)行治療，但是由于抗生素的廣泛及不合理使用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，特別是多重耐藥性問題更加突出。為防治該病，國內(nèi)外已研制出多種類型的基因工程菌苗和多價(jià)滅火菌苗，但由于大腸桿菌的血清型復(fù)雜及各地區(qū)流行菌株的不同，免疫效果尚不甚理想，一般以自制的滅火菌苗效果為佳。

為了解和掌握各地區(qū)大腸桿菌的耐藥程度，并為臨床上有效防治藥物的篩選提供依據(jù)，有必要對(duì)采集樣本中致病性大腸桿菌進(jìn)行生化和血清型鑒定。而一般性鑒定程序?yàn)椋悍蛛x培養(yǎng)→挑取可疑菌落→純培養(yǎng)→革蘭氏染色、鏡檢→生化試驗(yàn)。鑒定步驟為：將病料用生理鹽水稀釋，并接種于普通培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，觀察細(xì)菌生長情況和菌落特征，挑取單菌落接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h后，再挑取紅色、中等大小的光滑菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，染色情況、形態(tài)和大小等均符合大腸桿菌特征的菌株初步判定為大腸桿菌，挑取疑似菌株進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、H₂S試驗(yàn)、三糖鐵試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)合生化試驗(yàn)結(jié)果最終判定菌株屬種。但是該方法的鑒定結(jié)果尚不夠準(zhǔn)確，尤其是分離純化操作中菌落形態(tài)模糊，不利于挑取分離。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種豬源大腸桿菌的分離鑒定方法，該方法采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基分離純化病料菌株，生長出的菌落形態(tài)清晰，便于挑取分離，操作簡便，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，誤差小。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種豬源大腸桿菌的分離鑒定方法，包括以下步驟：

1)細(xì)菌分離培養(yǎng)：將采集的樣品接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后取菌液劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，挑取單個(gè)或成對(duì)的紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，挑取單個(gè)或成對(duì)的紫黑色菌落備用；

2)革蘭氏染色、鏡檢；

3)生化鑒定試驗(yàn)；

步驟1)中營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨7～8g，牛肉膏2～2.5g，氯化鈉3.5～4g，蒸餾水750mL，pH值7.0～7.4；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨12～18g，牛膽鹽3.5～4g，氯化鈉3.5～4g，瓊脂10～15g，乳糖7～8g，中性紅0.01～0.03g，蒸餾水750mL，pH值7.0～7.4；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨7.5～8.5g，乳糖7～8g，磷酸氫二鉀1.2～1.8g，瓊脂15～20g，2％伊紅水溶液12～18mL，0.5％美藍(lán)水溶液10～15mL，蒸餾水750mL，pH值7.2～7.4。