[發明專利]一種提高擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的方法

有效

• 申請號: 201611071540.4
• 申請日: 2016-11-29
• 公開（公告）號: CN106613838B
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 李唯奇;賈艷霞;林亮;袁彬
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: A01G31/00
• 分類號: A01G31/00;A01N3/00
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

本發明屬于冷凍再生技術領域，尤其涉及一種提高擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的方法，主要包括擬南芥莖尖的獲取、加載處理、植物微滴玻璃化處理、超低溫保存、解凍和卸載處理和恢復培養。此發明方法彌補了超低溫保存研究中有關細胞學變化方面的研究空白，同時也為提高植物莖尖超低溫保存再生率提供了方法支持，對研究超低溫保存技術具有重要意義。

技術領域

本發明屬于冷凍再生技術領域，尤其涉及一種提高擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的方法。

背景技術

植物超低溫保存(cryopreservation)是在液氮溫度下(-196℃)保存植物材料的方法。由于在液氮溫度下所有的細胞活動都暫時停止，所以理論上植物材料可以在不發生變化的情況下無限期保存。植物莖尖分生組織具有再生完整植株的能力，是植物超低溫保存的主要對象。植物超低溫技術發展的一個重要瓶頸是對超低溫處理過程細胞水平的研究非常有限。超低溫處理的主要對象是離體莖尖(分生組織)等具有再生能力的植物組織。在處理過程中，離體莖尖將經受預培養，滲透保護，脫水，液氮處理，解凍，復水和恢復培養等劇烈的人工處理。上述過程中，植物細胞膜系統和細胞骨架等將發生劇烈的變化和響應，這些變化及其恢復是超低溫處理方案成敗的關鍵。但是，植物莖尖超低溫保存過程中細胞骨架的變化模式是怎樣的，微管結構狀態與植物莖尖超低溫保存后的再生率的關系等問題尚不清楚。

發明內容

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的是在于提供一種提高擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的方法，旨在解決超低溫保存植物材料的問題。本發明以擬南芥莖尖為研究對象，解析了超低溫保存過程中細胞的微管變化模式，并通過加入微管穩定劑紫杉醇和促進微管解聚的藥物oryzalin來改變微管狀態，進而驗證微管結構對超低溫保存后植株再生率的影響。本發明方法彌補了超低溫保存技術中有關細胞學變化方面的研究空白，同時為提高植物莖尖超低溫保存再生率提供了方法支持，對研究超低溫保存技術有重要意義。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案予以實現。

一種提高擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的方法，該方法包括以下步驟：

(1)將消毒處理過的擬南芥種子播種在MS培養基上，經4-6℃低溫處理之后在22-25℃12h/12h晝夜周期的培養條件下培養一周獲得擬南芥幼苗，隨后在解剖鏡下切割莖尖；

(2)選取90個莖尖，平均分成三組，每組30個莖尖，第一組加入20μmol/L的紫杉醇并處理20分鐘，標記為T組；第二組加入20μmol/L的黃草消oryzalin處理20分鐘，標記為O組；第三組的莖尖直接標記為C組。

(3)加載處理，將T組、O組和C組莖尖同時放在加載溶液中，25℃下處理18-25分鐘；

(4)植物微滴玻璃化處理，在加載溶液處理結束以后，將三組莖尖同時轉入預冷的PVS2溶液，在冰上處理25-30分鐘；

(5)超低溫保存，將經過PVS2處理的莖尖轉移到無菌鋁箔條上并插入液氮中，待不再有氣泡產生時將鋁箔條轉入凍存管，并放置在液氮中保持30分鐘；

(6)解凍和卸載處理，將鋁箔條從液氮中移出并直接轉入卸載溶液中，并在25℃下處理20-30分鐘；

(7)恢復培養，將解凍后的莖尖轉移到恢復培養基上進行恢復培養，恢復培養的前7天為暗培養；暗培養之后，繼續在光照下培養，并定期統計南芥莖尖成活率。

進一步地，所述步驟(3)中加載溶液是含有2M甘油和0.4M蔗糖的MS培養液。

進一步地，所述步驟(4)中PVS2溶液是含有30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)DMSO和0.4M蔗糖的MS培養液。

進一步地，所述步驟(6)中卸載溶液是含有1.2M蔗糖的MS培養液。