[發明專利]一種基于微流控技術的仿生氣血屏障模型的構建方法

有效

• 申請號: 201611071507.1
• 申請日: 2016-11-29
• 公開（公告）號: CN108117990B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 秦建華;張敏
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發明提供一種基于微流控芯片技術的仿生肺氣血屏障模型構建方法，特別針對模擬構建肺氣血屏障的主要細胞組成和基質的三維排布。該微流控芯片主要由由基質入口池，兩個細胞入口池，廢液池，細胞培養室，基質室組成。該方法主要有以下步驟：(1)芯片基質灌注；(2)芯片細胞接種及培養；(3)芯片氣血屏障功能監測。基于該微流控芯片的肺氣血屏障模型構建方法具有更接近于體內氣血屏障組成和結構層次的特點，同時能夠實現對細胞層位置的準確定位。

技術領域

本發明涉及將微流控芯片技術應用到肺部生理/病理研究的技術領域，具體涉及一種基于微流控技術的仿生氣血屏障模型的構建方法。

背景技術

肺氣血屏障(Air-Blood Barrier，ABB)，又稱肺泡毛細血管屏障，是使肺泡與肺毛細血管緊密相連的組織結構,主要介導外界環境中的氣體與毛細血管內的血流之間的氣體交換。肺氣血屏障主要由肺泡表面液體層、I型肺泡上皮細胞層、細胞外基質和毛細血管內皮細胞層構成。肺氣血屏障的完整性對于維持肺臟正常氣體交換、防止血液中物質返流入間質和肺泡腔等至關重要。體外構建肺氣血屏障模型是開展肺部生理/病理相關機制研究的前提和基礎。然而，目前的研究手段主要依賴于孔板和商品化的transwell小室，以靜態二維細胞培養為基礎。但這種方式與體內細胞所處的三維微環境完全不同，也難以反映體內肺氣血屏障所包含的氣液界面、多細胞空間排列、血液流動等復雜的三維組織結構與生物力學微環境。

微流控芯片技術作為一門迅速發展起來的科學技術，已經在生物醫學領域展現了其獨特的優勢，更因其具有與細胞大小相匹配的微米尺寸構件，可在芯片微通道內進行多種細胞培養和流體刺激，構建與生理環境接近并具有時空分辨特點的三維微環境，已成為組織器官構建的重要創新技術。特別是微流控技術在多種微通道集成、流體界面形成及復雜細胞微環境模擬方面的功能特點，尤其適合于構建包含氣液界面、細胞、基質和流體等多因素共同構成的肺氣血屏障，是建立體外肺氣血屏障研究體系的理想平臺。該方面研究國內外尚無報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于微流控芯片的仿生氣血屏障模型的構建方法，特別針對模擬構建肺氣血屏障的主要細胞組成和基質的三維排布，該方法具有接近體內肺氣血屏障細胞和基質組成的特點，同時能夠實現對肺氣血屏障細胞和基質成分的動態變化進行實時動態觀察。

本發明提供了一種基于微流控芯片技術的屏障功能監測方法，監測的對象為兩層細胞和基質成分共同構成的仿生氣血屏障模型。

本發明提供的一種微流控芯片，該微流控芯片由上下兩層PDMS粘合封接而成，包括血管內皮細胞入口池，細胞外基質入口池，肺泡上皮細胞入口池，廢液池，血管內皮細胞培養室，肺泡上皮細胞培養室，基質室；

所述基質室兩端為細胞外基質入口池，中間部分為“豐”字形，中間的橫向結構為對稱排列著7～10個柵欄結構，基質室通過兩邊的柵欄結構與血管內皮細胞培養室和肺泡上皮細胞培養室連接；

所述血管內皮細胞培養室上連血管內皮細胞入口池，下連廢液池；肺泡上皮細胞培養室上連肺泡上皮細胞入口池，下連廢液池；

本發明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的兩部分組成，血管內皮細胞培養室和肺泡上皮細胞培養室高度為200-1000μm，基質入口池和基質室高度為100-300μm。

本發明還提供了一種基于微流控芯片技術的肺氣血屏障功能監測方法，方法過程如下：

(1)芯片基質灌注

采用matrigel工作液，用移液器將其加入基質入口池，每孔0.5-100μl；加PBS緩沖液于培養皿中，將固定芯片的培養皿放入培養箱中孵育20-60min凝膠，促使matrigel由粘稠狀液體變為果凍狀凝膠，凝膠過程結束后，從血管內皮細胞入口池和肺泡上皮細胞入口池分別加入兩種細胞的新鮮培養液；

(2)芯片細胞接種及培養