[發明專利]一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測探針的應用

有效

• 申請號: 201611065899.0
• 申請日: 2016-11-28
• 公開（公告）號: CN106706580B
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 吳迪;張麗鋒;方文軍;郭永勝
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/38
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 陳華

本發明涉及一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測探針的應用，所述綠色熒光蛋白突變體以綠色熒光蛋白為母體，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突變為左旋多巴。該方法操作簡單，鋁離子檢測限可達μmol·L^?1級，且選擇性高，滿足實際樣品的檢測需要。

技術領域

本發明涉及鋁離子檢測領域，具體涉及一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測探針的應用。

背景技術

鋁是一種常見的金屬，已經被廣泛地應用于生活中。但由于食物鏈堆積、亂用濫用等原因，鋁元素極易以鋁離子地形式影響生態環境，甚至進入人體內，導致大腦神經退化、記憶力衰退等。因此，對鋁離子在不同環境中的濃度檢測具有重要的意義。

目前，與傳統的元素檢測法，如原子吸收法、原子發射法和電感耦合等離子體質譜等方法相比，熒光探針檢測具有快速、便捷、靈敏度低等優點。但是，目前報導的熒光探針通常都是通過有機全合成的手段獲得，制備過程繁瑣，而且在合成過程中使用了大量有機試劑、重金屬催化劑等。為了檢測某種金屬離子，卻在檢測過程中造成了二次污染，有違綠色化學原則。此外，在生物醫藥分析中，很多檢測均在活體中進行，要求熒光探針具有高生物親和性，無毒無害、易于降解。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一種天然存在在于綠色熒光水母中的蛋白，由238個天然氨基酸構成。經過折疊后，其熒光生色團被很好地包裹在11個β-折疊嵌段之中，形成桶裝結構。其熒光發光穩定，效率高，是一種高效的熒光探針。此外，由于蛋白獲取過程不涉及任何毒害物質的使用，而且其生物相容性高，被廣泛地應用在分子標記、藥物篩選、抗體融合、生物傳感器等研究領域。

Ayyadurai等人(Bioconjugate chemistry,2011,22(4):551-555.)在酪氨酸缺陷型大腸桿菌中培養得到了一種非天然氨基酸嵌入的綠色熒光蛋白(GFPdopa)，蛋白氨基酸序列中的酪氨酸被左旋多巴所替代。該研究對GFPdopa的性質進了研究，但是并未公開將其應用于鋁離子的檢測。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測探針的應用，該方法操作簡單，鋁離子檢測限可達μmol·L^-1級，且選擇性高，滿足實際樣品的檢測需要。

本發明所提供的技術方案為：

一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測探針的應用，所述綠色熒光蛋白突變體以綠色熒光蛋白為母體，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突變為左旋多巴。

上述技術方案中，由于左旋多巴在水溶液體系中，對鋁離子有極高的親和性。因此當綠色熒光蛋白生色團中的酪氨酸被突變成左旋多巴后，生色團可以與游離的鋁離子進行配合，繼而產生熒光的變化。

所述綠色熒光蛋白母體氨基酸序列已經在Ayyadurai等(Bioconjugatechemistry,2011,22(4):551-555.)發表的文章中公開。

所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1。

所述綠色熒光蛋白是一種具有熒光生色團的桶狀蛋白，可以在正常大腸桿菌中進行表達，其最大熒光發射波長在450～550nm之間，其紫外最大吸收峰在450～550nm之間。

所述的綠色熒光蛋白突變體是在酪氨酸缺陷型大腸桿菌中表達；所述綠色熒光蛋白突變體氨基酸總數在為238(不包括Histag標簽)，相對分子量在25000～30000道爾頓之間。

作為優選，所述綠色熒光蛋白突變體經過透析、凍干后，分散到待測液中進行檢測。

作為優選，所述檢測溫度為4～60℃，反應時間在1～60min，待測液pH值為5～9。