[發明專利]一種基于定性濾紙的三維肝模型的建立及其應用

在審

• 申請號: 201611063673.7
• 申請日: 2016-11-28
• 公開（公告）號: CN108118025A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 秦建華;王亞清;王麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02;G01N33/68;G01N33/62
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發明提供了一種基于定性濾紙的三維肝模型的建立及其應用，該模型主要基于肝臟正常的生理結構特點，利用成纖維細胞直接誘導轉分化而來的肝細胞hiHep，對傳統的原代肝細胞或肝細胞系單層培養模型進行改進，將定性濾紙作為細胞培養的支架材料，將濾紙放置24孔板中使濾紙懸浮在培養液中，可進行充分的物質傳輸和營養成分的交換，從而使細胞在濾紙上進行三維生長。所述基于濾紙的肝模型即在定性濾紙上進行hiHep細胞與臍靜脈內皮細胞HUVEC共培養，實現了一種可體外長期培養并維持肝特異性功能的三維肝組織，利用它可以在體外進行一系列的肝毒性藥物的測試及評估，其主要作用是在體外研究藥物分子對肝臟組織的長期毒性及肝功能損傷的過程。

技術領域

本發明屬組織工程及藥物研究領域，具體涉及一種基于定性濾紙的三維肝模型的建立及其應用。

背景技術

人體眾多器官中，肝臟是人體內最大的腺體，有非常復雜的微結構，并擁有物質代謝、血液解毒和血漿蛋白分泌等多種功能，尤其是藥物和毒素代謝功能，對維持機體的穩定和代謝起到重要的作用。然而目前各種肝臟疾病嚴重威脅著人類健康，肝臟疾病的研究以及藥物篩選、毒性檢測方面大都還是依賴于動物實驗和臨床研究。由于物種之間的差異性，動物實驗的結果難以完全轉化到臨床中，藥物開發受到嚴重制約。而且在肝組織工程中，治療肝衰竭的傳統的肝臟移植方法一直面臨著器官供應短缺、免疫排斥以及倫理爭議等諸多問題。因此體外構建有功能性的肝組織或肝模型在研究藥物代謝、疾病模型構建、生物人工肝反應器、細胞移植治療等方面有著非常重要的研究和臨床應用價值。

肝細胞在體內有很強的再生功能，然而一旦剝離出肝臟或以傳統二維培養模式進行體外培養，就會很快失去增殖能力，喪失表型和正常的肝功能。因此在體外構建功能性的肝組織過程中，對體內肝細胞復雜微環境的模擬，實現體外肝細胞的三維培養，進而有效維持肝細胞的分化表型和改善肝細胞功能，就尤為重要。目前，體外維持肝細胞功能的方法有多種，包括利用非粘附性表面或帶有凹形微孔結構的芯片形成肝細胞球，中空纖維以及液滴包埋技術形成肝組織，或者用圖案化的細胞外基質和水凝膠支架材料構建肝組織。然而傳統的肝模型或肝反應器擁有許多的局限性，如肝細胞種類和來源有限，生物材料的性能及安全性差，體外細胞生長微環境難以長期維持，培養體系復雜難以擴大等。濾紙作為一種商業化、低成本、用途廣泛的材料，它的生物兼容性、穩定性較好，并且由束狀纖維素微纖維形成多孔的三維結構，因此濾紙非常適合作為細胞三維培養的支架材料。目前尚未有報道利用濾紙材料進行肝細胞的培養，并構建可進行體外長期培養的三維肝組織模型。

發明內容

基于上述原因，本發明利用一種新型肝細胞hiHep作為肝細胞來源，在濾紙上與臍靜脈內皮細胞HUVEC共培養構建三維肝組織模型。該培養體系能夠近似模擬體內肝組織微環境，使肝細胞形態和功能較長時間地維持，可以作為動物實驗的替代方法，在體外實現藥物長期作用于肝組織的毒性檢測或藥物篩選的能力。

本發明的目的是提供一種基于定性濾紙的三維肝模型的建立及應用，該模型可在體外長期維持肝細胞結構和功能，可用于藥物篩選和毒性檢測以及藥物開發等應用。

本發明提供了一種基于定性濾紙的三維肝模型的建立，具體步驟為：

將濾紙置于細胞培養24孔板中，在其上包被一層細胞外基質，然后在其上面先后種上一種內皮細胞和肝細胞，兩種細胞共培養一定時間后，得到具有肝特異性功能的三維肝組織，并能進行體外長期培養。

本發明提供的一種基于定性濾紙的三維肝模型的建立，所述肝細胞包括人原代肝細胞、肝細胞系、肝癌細胞系所有具有肝細胞結構和特異性功能的肝細胞。優選為一種由成纖維細胞直接誘導轉分化而來的肝細胞hiHep，此細胞系含有穩定轉染的大T抗原的EGFP基因，可自發綠色熒光。

本發明提供的一種基于定性濾紙的三維肝模型的建立，所述內皮細胞包括肝竇內皮細胞、臍靜脈內皮細胞、微血管內皮細胞所有具有血管內皮特征和功能的細胞，優選為臍靜脈內皮細胞HUVEC。