[發(fā)明專利]一種FFPE樣本中DNA質(zhì)量的評估方法

在審

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• 申請日: 2016-11-23
• 公開（公告）號: CN108103168A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 劉偉;王秀莉;董超;玄兆伶;李大為;梁峻彬;陳重建
• 申請（專利權(quán)）人: 安諾優(yōu)達基因科技（北京）有限公司;浙江安諾優(yōu)達生物科技有限公司;安諾優(yōu)達（義烏）醫(yī)學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種FFPE樣本中DNA質(zhì)量評估方法。總體而言，本發(fā)明通過核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8所示的引物對FFPE樣本DNA進行PCR擴增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果有效評估DNA質(zhì)量的等級，對FFPE樣本的DNA質(zhì)量準確分級。

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種FFPE樣本中DNA質(zhì)量的評估方法。

背景技術

福爾馬林固定石蠟包埋(Formalin-fixed and Paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)處理方法能夠較長時間地保存組織或制備檢驗所需的組織標本，所以在臨床病理檢驗、腫瘤基因檢測和醫(yī)學科學研究過程中常被用到。在世界范圍內(nèi)，大約有數(shù)十億份組織樣品保存在醫(yī)院或者組織樣品庫中。其中絕大多數(shù)是使用福爾馬林固定石蠟包埋的方法處理的樣品。數(shù)量巨大的歸檔FFPE樣本為回顧性研究、闡明疾病機制、發(fā)現(xiàn)治療靶標和指示預后等方面提供了寶貴的資源。

然而，甲醛作為福爾馬林的一個重要成分，可以引起核酸大分子之間以及核酸與蛋白質(zhì)之間的廣泛交聯(lián)，會影響組織內(nèi)DNA的提取質(zhì)量。影響FFPE組織DNA質(zhì)量的因素有很多，通常包括：1.固定前因素，如組織的類型和大小，固定前它的腐敗程度等；2.固定因素，如選取何種固定液，固定液的pH值，溫度以及固定時間的長短等；3.固定后因素，如固定后儲存時間的長短和儲存溫度的高低等。這些因素導致提取的FFPE樣本中DNA質(zhì)量差別很大。

目前，用于FFPE樣本DNA質(zhì)量的評估方法有：RAPD-PCR(Randomly amplifiedpolymorphic DNA-PCR，隨機擴增多態(tài)性DNA-PCR)方法和QPCR方法等方法。其中，RAPD-PCR是在PCR的基礎上發(fā)展起來的一種實驗技術。該方法僅用一個8～10nt的寡核苷酸引物，引物的序列是隨機的，反應的條件與普通PCR基本相同。本方法對FFPE樣本DNA進行擴增，產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳得到RAPD圖譜，根據(jù)圖譜中條帶多少與強弱給出DNA質(zhì)量結(jié)果。但是該方法獲得的結(jié)果某些帶重復性較差，而且該方法使用隨機引物，擴增出的片段是非特異性的，根據(jù)RAPD圖譜較難制定出FFPE樣本DNA質(zhì)量評估標準。qPCR方法使用兩對目的片段長度不同(42bp、123bp)的引物分別進行qPCR反應，分別得到兩個ΔCq值，根據(jù)ΔΔCq值給出質(zhì)量結(jié)果。而該方法基因組DNA同一位置設計兩對引物，兩對引物的目的片段長度不同，通過比較ΔΔCq值來評估FFPE樣本DNA質(zhì)量。在基因組同一位置設計引物只能評估FFPE樣本DNA在該位置降解情況，比較片面，不能充分反映FFPE樣本DNA整體質(zhì)量情況，誤差較大。

隨著二代測序技術的發(fā)展，大大地提高了樣本測序速度，降低了測序成本，使得應用二代測序方法對FFPE樣本DNA進行測序成為可能。然而FFPE樣本常存在數(shù)量少、質(zhì)量差的問題。不同質(zhì)量的FFPE樣本獲得的DNA質(zhì)量差異很大，對這樣的DNA樣本均采用相同的建庫策略，如相同的起始量或者相同的文庫構(gòu)建方法，將會直接影響文庫的產(chǎn)量，嚴重的將無法進行測序研究。現(xiàn)有的FFPE樣本DNA質(zhì)量評價方法通常分級較少如僅分兩級，且檢測目標區(qū)域單一，因而無法對FFPE樣本的DNA質(zhì)量進行合理的等級劃分，亦不能對后續(xù)的樣本提取DNA片段的建庫過程給予合理的指導。因此現(xiàn)有的FFPE樣本DNA質(zhì)量評價方法仍有待改進。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種FFPE樣本中DNA質(zhì)量的評估方法。利用SEQ ID NO：1～8所示核苷酸序列組成五對引物對FFPE樣本DNA進行擴增，再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)目的條帶擴增情況可將FFPE樣本DNA劃分為不同的質(zhì)量等級。

即，本發(fā)明包括：

1.一種FFPE樣本中DNA質(zhì)量的評估方法，該評估方法包括:

步驟B：利用擴增試劑對提取的FFPE樣本的DNA進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；以及

步驟C：將擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，根據(jù)電泳檢測結(jié)果評估FFPE樣本中DNA的質(zhì)量等級，