[發(fā)明專利]一種高通量形成擬胚體的微陣列芯片的制備方法與應(yīng)用

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• 申請日: 2016-11-26
• 公開（公告）號: CN108121161A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦建華;王麗;尹方超
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: G03F7/20
• 分類號: G03F7/20;C12M3/00
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發(fā)明提供一種高通量形成擬胚體的微陣列芯片的制備方法與應(yīng)用，該方法利用軟蝕刻技術(shù)制備了具有微米尺度的陣列微柱結(jié)構(gòu)的PDMS聚合物芯片。通過優(yōu)化微柱結(jié)構(gòu)的高度和間距來控制干細(xì)胞來源的擬胚體的形狀、大小、均一性。該方法可以高通量形成擬胚體，并可以原位動態(tài)觀察擬胚體增殖、發(fā)育的全過程。該芯片具有可以有效去除凋亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片，保證擬胚體之間的營養(yǎng)供給和信號傳遞的特點，克服了傳統(tǒng)擬胚體形成和懸浮培養(yǎng)分步實現(xiàn)的缺點，具有簡化擬胚體操作步驟，高通量、原位形成與分化的優(yōu)勢，無需特殊的儀器和試劑，可與其他技術(shù)集成化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高通量形成擬胚體的微陣列芯片的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，在人體發(fā)育學(xué)研究，疾病模型構(gòu)建，組織工程，細(xì)胞治療，藥物篩選等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。利用該細(xì)胞進(jìn)行器官發(fā)育和細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，擬胚體形成是關(guān)鍵的步驟。傳統(tǒng)方法是利用懸滴法、以及商品化的小坑形成擬胚體。懸滴法具有操作繁瑣，擬胚體形成效率低，營養(yǎng)供給缺乏等缺點。商品化的小坑結(jié)構(gòu)在擬胚體形成后，由于小坑的結(jié)構(gòu)使得死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片很難清除，這些細(xì)胞碎片會影響擬胚體的分化誘導(dǎo)效率。因此，應(yīng)用這些方法形成擬胚體后，需要將擬胚體轉(zhuǎn)移到低黏附的培養(yǎng)板中繼續(xù)生長以及后續(xù)的誘導(dǎo)分化，使得實驗步驟繁瑣。此外，在轉(zhuǎn)移過程中，擬胚體容易收到較大流體的剪切力刺激，干擾細(xì)胞的活性和分化的效果。

制備高通量陣列微柱結(jié)構(gòu)的芯片的材料為聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，PDMS是目前微加工和微流控領(lǐng)域用的最多的材料，具有透明、透氣、惰性好、疏水性、易成型、細(xì)胞相容性佳等優(yōu)勢。目前文獻(xiàn)報道的制備細(xì)胞球或者擬胚體的方法都是基于PDMS或者聚合物凝膠材料的小坑法，進(jìn)一步研究需要轉(zhuǎn)移細(xì)胞微球和擬胚體到新的低黏附培養(yǎng)系統(tǒng)，步驟繁瑣；轉(zhuǎn)移過程中對干細(xì)胞會造成一定程度的損傷，細(xì)胞碎屑不容易清除等缺點。目前形成擬胚體的方法是微流控技術(shù)的小坑芯片和懸滴法，主要缺陷是死亡細(xì)胞碎片不能及時清除，需要轉(zhuǎn)移到新的低粘附培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)和分化，轉(zhuǎn)移過程對擬胚體具有不同程度的損傷和丟失，而且無法實現(xiàn)原位擬胚體形成及培養(yǎng)，不能實時定位觀察同一個擬胚體的發(fā)育分化過程。

目前利用微流控芯片制備的微柱結(jié)構(gòu)中，主要以微小尺度為主，用于研究表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對單細(xì)胞行為學(xué)的影響，尚無利用較大微柱形成微培養(yǎng)空間進(jìn)行擬胚體形成和原位發(fā)育研究的應(yīng)用。

因此，本發(fā)明主要針對上述擬胚體形成局限性，制備一種新型的高通量擬胚體形成與原位生長培養(yǎng)的芯片，用于干細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用研究。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明的目的一種高通量形成擬胚體的微陣列芯片的制備方法與應(yīng)用。

一種高通量形成擬胚體的微陣列芯片的制備方法，具體步驟如下：

(1)芯片的制備：利用軟蝕刻技術(shù)制備SU-8模板，含有高通量圓柱形的凹陷結(jié)構(gòu)，底部為凹陷的曲面，對模板進(jìn)行低黏附修飾，確保SU-8與PDMS聚合物容易剝離；

(2)制作高通量陣列微柱結(jié)構(gòu)的PDMS聚合物芯片：將PDMS聚合物與引發(fā)劑按照體積比10～14：1混合，澆注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加熱固化1～2h，常溫剝離SU-8模板，得到高通量的固定間距的陣列微柱結(jié)構(gòu)PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周邊用PDMS模塊形成圍墻樣結(jié)構(gòu)的局限的開放培養(yǎng)池，得到高通量形成擬胚體的微陣列芯片。

芯片形狀為圓形或者方形。

所述模板低黏附修飾具體為：采用低粘附處理試劑硅烷化處理10-15分鐘，80℃烘烤1～2小時，自然降溫。

所述低粘附處理試劑為三甲基氯硅烷或者全氟硅烷等；

所述模板凹陷小坑的深度在500-1000微米之間，間距在30-100微米之間。