[發(fā)明專利]從冰菜中篩選耐高鹽固氮菌株的方法及相關(guān)培養(yǎng)基有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201611056271.4 | 申請日： | 2016-11-26 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN106754481B | 公開（公告）日： | 2020-02-07 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張建;王朋成;江海坤;王艷;方凌;嚴(yán)從生;張其安;王明霞 | 申請（專利權(quán)）人： | 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 |
| 主分類號(hào)： | C12N1/20 | 分類號(hào)： | C12N1/20;C12N1/02;C12R1/065 |
| 代理公司： | 11465 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 230001 *** | 國省代碼： | 安徽;34 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 菌株 固氮菌株 斜面固體培養(yǎng)基 耐高鹽 冰菜 制備 生長 細(xì)菌 篩選 菌株分離 菌株培養(yǎng) 平板涂布 生物菌株 土壤治理 斜面培養(yǎng) 植物樣品 培養(yǎng)基 固定氮 耐鹽菌 固氮 耐鹽 | ||
1.一種從冰菜中篩選耐高鹽固氮菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)制備細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基
按以下配方配制固氮培養(yǎng)基，并將配制的固氮培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的固氮培養(yǎng)基滅菌25分鐘，得到細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基，所述固氮培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氫鉀0.5g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.01g、混合溶液10mL、氯化鈉10.0g、瓊脂15.0～20.0g和蒸餾水1000mL；
(2)制備冰菜植物樣品
a)取新鮮的冰菜樣品，進(jìn)行表面消毒，具體步驟如下：采用75％乙醇處理3～5min，之后用無菌水清洗3～5次，再用0.5％次氯酸鈉處理5min，再使用無菌水清洗3～5次；
b)稱取5g表面消毒后的冰菜樣品，加入滅菌研缽中，并加入10mL無菌生理鹽水，研磨成勻漿溶液A；
c)吸取所述勻漿溶液A 1mL，加入9mL無菌生理鹽水，振蕩1分鐘，得到10-1的稀釋勻漿溶液B；
d)吸取所述稀釋勻漿溶液B 1mL，加入9mL無菌生理鹽水，得到10-2的稀釋勻漿溶液C；
e)吸取所述稀釋勻漿溶液C 1mL，加入9mL無菌生理鹽水，得到10-3的稀釋勻漿溶液D；
f)吸取所述稀釋勻漿溶液D 1mL，加入9mL無菌生理鹽水，得到10-4的稀釋勻漿溶液E；
g)吸取所述稀釋勻漿溶液E 1mL，加入9mL無菌生理鹽水，得到10-5的稀釋勻漿溶液F；
(3)分別吸取所述稀釋勻漿溶液D、稀釋勻漿溶液E和稀釋勻漿溶液F各0.2mL，加入到所述細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基中進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)，并在25～28℃下培養(yǎng)4～5天；
(4)從步驟(3)的培養(yǎng)結(jié)果中挑取菌落，選擇20～200菌落數(shù)的培養(yǎng)皿在所述細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，并在25～28℃下培養(yǎng)4～5天；
(5) 對步驟(4) 的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行分離，得到耐高鹽固氮菌株；
所述固氮培養(yǎng)基中的混合溶液的組分為：鉬酸鈉 0.025g 、硫酸亞鐵 0.001g 、三氯化鐵 0.05g 、生物素 0.05g ，硫酸錳 0.02g 、硫酸銅 0.008g ，用蒸餾水定容至 100mL ，并且，定容后要用0.22 μ m 濾膜過濾除菌才得所述混合溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從冰菜中篩選耐高鹽固氮菌株的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括：
(6)耐高鹽固氮菌株的穩(wěn)定生長
a)制備生長固氮培養(yǎng)基：按以下配方配制生長固氮培養(yǎng)基，并將配制的生長固氮培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的生長固氮培養(yǎng)基滅菌25分鐘，所述生長固氮培養(yǎng)基成分為：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.2g、氯化鈉、混合溶液10mL、瓊脂15.0～20.0g和蒸餾水1000mL，并且，依據(jù)所述氯化鈉的含量分別為10g、12g、15g、18g和21g而配制成多種不同的生長固氮培養(yǎng)基；
b)將所述步驟(5)得到的耐高鹽固氮菌株依次在含有10g、12g、15g、18g和21g氯化鈉的不同生長固氮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在每種生長固氮培養(yǎng)基中在25～28℃條件下培養(yǎng)4～5天，最終純化獲得的菌株即為耐高鹽固氮菌株；
所述生長固氮培養(yǎng)基中的混合溶液的組分為：鉬酸鈉0.025g、硫酸亞鐵0.001g、三氯化鐵0.05g、生物素0.05g，硫酸錳0.02g、硫酸銅0.008g，用蒸餾水定容至100mL，并且，定容后要用0.22μm濾膜過濾除菌才得所述混合溶液。
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