[發(fā)明專(zhuān)利]用于靶向抑制HIV-1前病毒表達(dá)的表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611054126.2
• 申請(qǐng)日: 2016-11-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108103094B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱煥章;鄧俊驍;季海燕;朱豫琪
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N15/62;A61K48/00;A61P31/18
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，涉及嵌合鋅指結(jié)構(gòu)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶靶向抑制HIV?1前病毒表達(dá)的表達(dá)載體的制備及應(yīng)用；本發(fā)明的攜帶嵌合鋅指結(jié)構(gòu)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體經(jīng)在HIV?1感染及潛伏感染細(xì)胞模型中證實(shí)可抑制HIV?1前病毒表達(dá)的沉默，該種載體在病毒感染細(xì)胞和潛伏感染細(xì)胞中能有效的抑制病毒復(fù)制,且可持續(xù)15天和40天以上。此外，嵌合鋅指結(jié)構(gòu)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體造成的前病毒表達(dá)沉默能夠在細(xì)胞代際之間遺傳且在細(xì)胞中具有一定的安全性。本發(fā)明為治愈艾滋病提供了新的思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及用于靶向抑制HIV-1前病毒表達(dá)的表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及用于靶向抑制HIV-1前病毒表達(dá)的嵌合鋅指結(jié)構(gòu)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)

研究顯示，艾滋病(Acquired immunodeficiency virus，AIDS)不能被完全治愈的主要原因是由于HIV-1藏匿于其感染的免疫細(xì)胞，可通過(guò)表觀(guān)遺傳等機(jī)制發(fā)生基因沉默(gene silencing)，從而逃避免疫系統(tǒng)和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的攻擊。然而，研究還顯示，這些潛伏感染細(xì)胞中的HIV-1前病毒的基因沉默具有可逆性，一旦遇到適當(dāng)?shù)臈l件，病毒又能迅速恢復(fù)其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，進(jìn)而引發(fā)病毒的再次感染。有研究人員認(rèn)為，倘如將潛伏感染細(xì)胞中的HIV-1前病毒永久沉默，則有可能實(shí)現(xiàn)宿主和HIV-1病毒“和平共處”的狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)功能性治愈。

有報(bào)道，與HIV-1病毒極為相似的人類(lèi)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(human endogenousretroviruses,HERV)被認(rèn)為是整合到人類(lèi)基因組中的古老逆轉(zhuǎn)錄病毒，它們可對(duì)人體產(chǎn)生破壞，但因強(qiáng)大的人類(lèi)基因組最終將其同化，使其成為基因組的一部分，與人類(lèi)宿主“和平共處”，甚至幫助宿主調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄或抵抗新的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。有研究人員認(rèn)為，倘如能?chē)?yán)格調(diào)控HIV-1潛伏感染細(xì)胞中的前病毒，使其病毒的轉(zhuǎn)錄受到穩(wěn)定的抑制，阻止病毒載量的反彈，或許能夠使得HIV-1像HERV一樣，實(shí)現(xiàn)宿主和HIV-1病毒“和平共處”的狀態(tài)，達(dá)到功能性治愈。

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了DNA甲基化是哺乳動(dòng)物中常見(jiàn)的表觀(guān)遺傳標(biāo)志，是基因組印記、轉(zhuǎn)座子沉默和差異化基因表達(dá)的表觀(guān)遺傳學(xué)機(jī)制。DNA甲基化發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基上，常見(jiàn)于CpG島(CpG islands,CGIs)樣的CpG富集區(qū)域。傳統(tǒng)的甲基化建立-維持模型將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶分為從頭甲基轉(zhuǎn)移酶(de novo DNMT)和維持甲基轉(zhuǎn)移酶(MaintenanceDNMT)兩大類(lèi)；前者主要是Dnmt3a和Dnmt3b，它們負(fù)責(zé)甲基化的建立，在胚胎發(fā)育過(guò)程中起重要作用；后者主要是Dnmt1，它對(duì)半甲基化的DNA序列具有很高的親和性，負(fù)責(zé)在DNA復(fù)制過(guò)程中將甲基化標(biāo)記傳遞給子代。此外，DNA甲基化模式還能在細(xì)胞代際之間遺傳，對(duì)甲基化的基因保持長(zhǎng)期穩(wěn)定的抑制。2013年，Martinez-Colom A等構(gòu)建了含有可靶向HIV-1調(diào)控區(qū)LTR(Long terminal repeat)的HIV-1整合酶結(jié)構(gòu)域和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt3b的催化域的嵌合蛋白表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)該嵌合蛋白可以引起HIV-1調(diào)控區(qū)甲基化并導(dǎo)致HIV-1表達(dá)抑制，但是，HIV-1整合酶存在著“脫靶”的安全性隱患。最近，基于ZFN(Zinc fingernuclease)、TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)和CRISPR系統(tǒng)(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat)的基因編輯技術(shù)的問(wèn)世為該問(wèn)題的解決開(kāi)辟了新的途徑。Li等利用嵌合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的ZFP重組蛋白靶向HSV基因啟動(dòng)子區(qū)域，實(shí)現(xiàn)了因靶基因甲基化致使基因沉默的目的；Blancafort等將六鋅指結(jié)構(gòu)與Dnmt3a結(jié)合，成功誘導(dǎo)了Maspin和SOX2基因啟動(dòng)子位點(diǎn)的DNA甲基化，使得基因表達(dá)下調(diào)；同時(shí)，該研究表明這種沉默作用能夠在體內(nèi)持續(xù)存在。最近，Aleksandar等將內(nèi)切酶失活的Cas9核酸酶(dCas9)與Dnmt3a的催化結(jié)構(gòu)域融合并成功靶向了IL6ST和BACH2基因，使得基因表達(dá)下調(diào)。