[發明專利]一種以惡臭假單胞菌為出發菌株構建三氯丙烷降解菌的方法

有效

• 申請號: 201611048418.5
• 申請日: 2016-11-24
• 公開（公告）號: CN106754591B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 楊超;宮婷;宋存江;徐曉慶;左振強;劉瑞華
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12R1/40
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種以惡臭假單胞菌為出發菌株建立三氯丙烷降解菌的方法。本發明屬于環境技術修復領域，涉及一種在惡臭假單胞菌中穩定高效表達三氯丙烷降解途徑中三個基因dhaA31，hheC和echA的方法及該工程菌的實際應用。優化外源基因的密碼子，替換原始基因的啟動子及核糖體結合位點，使用無痕的插入方法將優化后的表達框分別整合至惡臭假單胞菌的基因組中，得到穩定且高效表達三氯丙烷降解基因的工程菌。工程菌株接種至工業污水小試裝置中，可以在兩天內降解2mM/L的三氯丙烷。該發明的工程菌株在小試裝置中的出色表現，使其在大規模處理工業污染廢水中具有巨大的潛力。

技術領域

本發明屬于環境技術修復領域，具體涉及一種以惡臭假單胞菌為出發菌株三氯丙烷降解菌株的構建方法.。

背景技術

人工合成物質1，2，3-三氯丙烷TCP在世界范圍內的產量高達5000噸/年，被化學公司作為溶劑，上壤熏蒸劑的前體，及作為合成其他化合物的結構單元，例如二氯丙烯和聚砜類物質。TCP還是環氧氯丙烷合成過程中的副產品。在其大量的生產中，TCP經常在工業和有害廢物的地點被發現。最近的一次加利福尼亞TCP污染引用水的事件表明亟需從環境中高效去除TCP這一有毒致癌物質的技術。目前還沒有從環境中分離出有氧條件下利用TCP的菌株。

工程菌實際應用于有機物污染的修復必須具有遺傳穩定、不含外源抗性等特點，將外源基因通過同源重組的方法整合到受體菌染色體上是一種理想的方法。另一方面，由于轉基因微生物(基因工程菌)的復雜性和不確定性，其環境釋放的安全性受到廣泛關注，因此，工程菌在應用前必須進行環境釋放安全性評價。人們所期望的結果是：投加的工程菌降解污中污染物以后，它們又會在污水中逐漸消亡，不會成為優勢菌，也不會逃逸到釋放區外，而且，工程菌的投加也不會對污水微生物數量和群落結構產生顯著影響。

Pseudomonas putida是重要的環境微生物模式菌株，其基因組已在2002年被測序和解析。盡管Pseudomonas putida與致病的銅綠假單胞菌有極高程度的基因組保守性(分享85％的預測編碼區域)，但是不存在關鍵的毒力因子包括外毒素A和III型分泌系統。Pseudomonas putida是第一個被美國衛生部重組DNA委員會認定為對環境安全的革蘭氏陰性細菌，并允許該菌株作為基因工程的宿主菌。基因組序列分析表明，Pseudomonas putida在生物催化、生物降解和PHA合成等領域具有潛在應用價值。

由于Pseudomonas putida是一種理想的用于水環境修復的菌株，因此以Pseudomonas putida作為底盤細胞，導入不同功能的降解基因并實現它們在宿主菌中的異源表達，有望構建出生長速度快、降解能力強、降解譜廣的新型工程菌。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種三氯丙烷降解菌的構建方法，是以Pseudomonasputida為出發菌株進行構建的，出發菌株分類名為惡臭假單胞菌。

本發明構建的三氯丙烷降解菌，是對從土壤環境分離得到的惡臭假單胞菌進行基因工程改造獲得的菌；所述基因工程改造為插入與三氯丙烷降解途徑中相關的多個基因；所述與三氯丙烷降解途徑相關的多個基因為鹵代烷脫鹵酶(DhaA31)編碼基因，鹵代醇脫鹵酶(HheC)編碼基因和環氧化物水解酶(EchA)編碼基因。

上述鹵代烷脫鹵酶(haloalkane dehalogenase)DhaA31的核苷酸序列為SEQ IDNO.1中的dhaA31序列；鹵代醇脫鹵酶(halohydrin dehalogenase)HheC的核苷酸序列表為SEQ ID NO.2中的hheC序列；環氧化物水解酶(expoxide hydrolase)EchA的核苷酸序列表為SEQ ID NO.3中的echA序列。

本發明的第二個目的是提供三氯丙烷于高濃度三氯丙烷環境下在提高三氯丙烷污染地下水中三氯丙烷降解率的應用，所述的高濃度三氯丙烷環境為含三氯丙烷摩爾濃度為0～2mM/L的水。

附圖說明