[發明專利]一種動物源食品中99種獸藥殘留的高通量檢測方法

有效

• 申請號: 201611046606.4
• 申請日: 2016-11-23
• 公開（公告）號: CN106596819B
• 公開（公告）日: 2018-01-02
• 發明（設計）人: 陳樹兵;陳先鋒;李雙;朱海強;方科益;勞華均
• 申請（專利權）人: 寧波出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙)33226
• 代理人: 何仲

1.一種動物源食品中99種獸藥殘留的高通量檢測方法，其特征在于具體步驟如下：

(1)樣品前處理

稱取液體樣品5.00g或者濃度為1g/mL的固體水溶液5mL于50mL離心管中，加入5mL提取液，10mL乙腈，渦旋充分混勻，以4500r/min離心5min，上清液轉移至另一50mL離心管中，再在上清液中加入1g硫酸銨，充分混勻后離心5min，得到上層乙腈相和下層水相，取下層水相過硅藻土柱，下接50ml離心管，并加入0.5ml二甲基亞砜得到上樣液；將上樣液上硅藻土柱后平衡15分鐘，然后將上層乙腈相過硅藻土柱進行洗脫，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗離心管中殘余的上樣液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脫液用純乙腈定容至25ml；將定容液均分為2份，分別置于15ml具刻度離心管中，在微弱的氮氣流下吹干至1ml，用純水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml離心管中，于-4℃，15000r/min下離心10min，然后取400μL上清液置于帶襯管的進樣瓶中進樣分析；同時做試劑空白樣品；其中所述提取液的制備方法為：稱取4.3g的草酸和3.7g的乙二胺四乙酸二鈉，用500ml的水溶解，氨水調pH至3.0；

(2)混合標準溶液組成和基質標準曲線制備

A.混合標準溶液組成：

磺胺類包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲異嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺間甲氧嘧啶，磺胺對甲氧嘧啶，磺胺喹惡啉，磺胺二甲惡唑，磺胺二甲異惡唑，磺胺甲惡唑，磺胺噻唑，磺胺氯噠嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧芐胺嘧啶和磺胺胍，各成分濃度均為1.0μg/mL；

喹諾酮類包括乙胺嘧啶,環丙沙星,恩諾沙星,氧氟沙星,諾氟沙星,沙拉沙星,培氟沙星,奈啶酸,奧索利酸,氟甲奎,吡哌酸,西諾沙星,麻保沙星,司帕沙星,雙氟沙星,單諾沙星,奧比沙星,洛美沙星和依諾沙星，各成分濃度均為1.0μg/mL；

激素類包括可的松，潑尼松，甲基潑尼松龍，炔諾酮，炔雌醇，醋酸美侖孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羥孕酮，雌酮，氫化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睪酮，潑尼松龍，雌二醇，己烯雌酚，甲睪酮，表睪酮，丙酸睪酮，苯甲酸雌二醇，追寶龍，諾龍，甲孕酮和17α-羥基孕酮，各成分濃度均為0.1μg/mL；

紅霉素類包括紅霉素，替米考星，竹桃霉素，泰樂霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分濃度均為0.1μg/mL；

孔雀石綠類包括孔雀石綠，隱色孔雀石綠，結晶紫和隱色結晶紫，各成分濃度均為0.1μg/mL；

青霉素類包括氨芐青霉素，乙氧萘青霉素，鄰氯青霉素，頭孢氨芐，雙氯青霉素，青霉素G和阿莫西林，各成分濃度均為1.0μg/mL；

四環素類包括土霉素，強力霉素，金霉素和四環素，各成分濃度均為1.0μg/mL；氨苯砜類包括金剛乙胺，苯乙醇胺A，N-乙酰氨苯砜，氨苯砜，金剛烷胺，吡喹酮和氯丙嗪，各成分濃度均為0.1μg/mL；

B.基質標準曲線定量：

在空白樣品中分別加入上述8類混合標準溶液0μL，10μL，20μL，40μL，100μL，以濃度為橫坐標，儀器響應值為縱坐標，做基質加標標準曲線，作為試樣處理液中待測物濃度定量的依據；其中響應值＝標準品峰面積/標準品質量；

(3)超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用測定

A.高效液相分離

色譜柱：Hypersile Gold C18色譜柱，若測定激素成分則采用的型號為100mmx 2.1mm,1.9μm，若測定混合標準溶液中的其余成分則采用的型號為100mmx 2.1mm,3μm；

若測定激素成分，則流動相A：含有0.1wt％氨水的甲醇溶液；流動相B：含有0.1wt％氨水的水-甲醇溶液，其中水與甲醇的體積比為95:5；

若測定混合標準溶液中的其余成分則：流動相A：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸銨的乙腈-水溶液，其中乙腈與水的體積比為95:5；流動相B：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸銨的水-乙腈溶液，其中水與乙腈的體積比為95:5；

流速：0.3mL/min；

進樣量：10mL；

若測定激素成分HPLC洗脫程序如下：

若測定混合標準溶液中的其余成分則HPLC洗脫程序如下：

B.質譜檢測

離子源：HESI-II；

噴霧電壓：若測定激素成分則采用正離子模式3800V/負離子模式2700V；若測

定混合標準溶液中的其余成分則采用正離子模式3800V；

氣化溫度：350℃；

鞘氣壓：N₂，35arb；

輔助氣壓：N₂，10arb；

離子傳輸管管溫度：300℃；

質量范圍：m/z 100-1000；分辨率R＝70000；

(4)濃度計算方法

樣品中待測物的含量根據如下計算公式(1)得到：

X＝2*C*V/m，式中：

X－試樣中待測物含量，單位為μg/kg；

C－試樣處理液中待測物濃度，根據基質標準曲線計算得到，單位為μg/L

V—定容體積，單位為mL；

m－試樣體積或質量，單位為g。