[發明專利]一種融合蛋白、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201611044569.3
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN106749673B
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 張紫寒;于文濤;張震宇;劉崇東
• 申請（專利權）人: 張震宇
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K39/00;A61P35/00
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• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種融合蛋白、制備方法及其應用。一種融合蛋白，所述蛋白包括CLIC1蛋白、連接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通過連接肽與Hsp27蛋白連接。本發明所述融合蛋白可以應用于腫瘤防治藥物制備中，具有特異性好、抗原高效等優點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種融合蛋白、制備方法及其應用。

背景技術

卵巢癌、子宮頸癌和子宮內膜癌是三種惡性腫瘤嚴重威脅女性生命健康，五年存活率不足50％，子宮頸癌發病率居女性生殖系統腫瘤之首，我國新發病例每年高達15萬之多，而且有明顯的年輕化趨勢，國家已經廣泛開展“兩癌篩查”，但是仍然未能改善腫瘤患者的預后，女性生殖系統惡性腫瘤是我國中長期科技發展綱要計劃攻關的惡性腫瘤之一。女性生殖系統惡性腫瘤的傳統治療為手術、放療、化療，但是僅僅有一定療效，對于晚期或復發患者均不能奏效，目前急需尋找新的治療方法。

發明內容

鑒于現有技術所存在的問題，本發明提供一種融合蛋白、制備方法及其應用。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種融合蛋白，所述蛋白包括CLIC1蛋白、連接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通過連接肽與Hsp27蛋白連接。

采用上述方案的有益效果是:

發明人通過蛋白質組學，免疫組化，RT-PCR，western blot等研究方法，發現CLIC1(細胞內氯離子通道蛋白1，氯離子通道蛋白是一組調節基本細胞功能的蛋白，包括細胞膜電位穩定、跨膜轉運、維持胞內pH，調節細胞容積)在卵巢癌組織中呈現高表達，CLIC1被發現和細胞周期相關，在細胞G2/M期表達于細胞膜上,應用CLIC 1特異性拮抗劑阻斷該離子通道后，細胞的有絲分裂受到影響，細胞周期停滯于G2/M期，推測CLIC1在卵巢細胞周期中參與了調節這一過程，發明人進一步通過建立CLIC1基因敲降和過表達的細胞系，在體外試驗中證實CLIC 1在SKOV3和A2780卵巢癌細胞系中呈現高表達，抑制CLIC1的表達可以減少卵巢癌細胞系的增殖及浸潤，提示CLIC 1可能是參與卵巢癌發生及淋巴道轉移的重要基因之一，在此前國內外均尚未見相關報道。

進一步，發明人將CLIC1基因和人HSP27基因(熱休克蛋白27，屬于低分子量熱休克蛋白家族的成員，HSP27是一個涉及到藥物抗性、細胞生長、細胞凋亡、腫瘤的發生和轉移等功能的重要蛋白，HSP27介導的這些功能可能與其對其它蛋白質的影響有關)通過一段柔性連接肽進行人工融合，合成一種CLIC1-HSP27的融合基因，采用基因聯合優化技術在原核表達系統中成功實現了該融合基因的高表達，通過質譜鑒定和親和層析純化獲得了純度大于90％的CLIC1-HSP27融合蛋白，該融合蛋白標準品成功解決現有腫瘤細胞裂解物成分復雜，無法保證所誘發抗腫瘤免疫的強度和特異性的缺點，并且成分單一，結構明確，降低成本，方便于工業化生產，為以后的生物學研究打下基礎，非常具有應用前景。

進一步，所述融合蛋白包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

采用上述方案的有益效果是：有現有技術進行改進，摸索出基因聯合優化技術，從密碼子優化，mRNA結構優化，基因表達優化三方面聯合入手，通過對稀有密碼子、mRNA結構、表達菌株的篩選、純化的溫度、誘導度、培養基OD值探索，提高外源基因的表達效率、可溶性和穩定性，提升表達產量和準確性，后期質譜測序與原始預測序列在存在誤差的情況下符合率接近100％，傳統技術一般為60％-80％左右。

進一步，所述連接肽為柔性連接肽。

采用上述方案的有益效果是：

采用柔性的連接肽有利于：增加產物的穩定性，選甘氨酸作為融合蛋白linker是因為甘氨酸是所有氨基酸中最小且沒有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之間不會影響兩邊蛋白的構象和功能發揮，采用的linker不能太大，否則一是對結構有影響，二是增加了融合蛋白的抗原性。