[發(fā)明專利]一種11α-羥基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611044553.2
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN108085359B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設計）人: 李哲;余偉;李佳;劉美龍
• 申請（專利權）人: 保定九孚生化有限公司
• 主分類號: C12P33/10
• 分類號: C12P33/10;C12R1/66;C12R1/845
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤

1.一種11α-羥基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:

( 1) .收集所需菌種的孢子并進行種子培養(yǎng)：

( 1.1) 孢子茄形瓶生產(chǎn)

將保存的赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500的種子接種到固體斜面培養(yǎng)基上，放置于28℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7-10天后，斜面表層孢子為灰白色，斜面背面為暗紅色有褶皺；然后，放到4度冷藏備用；

所述固體斜面培養(yǎng)基包括以下組分：

葡萄糖20g/L，蛋白胨1.0g/L，麥芽提取物20g/L，瓊脂粉20g/L，消毒前pH調(diào)節(jié)到5.5-6.0；

( 1.2) 一級種子罐

將步驟1的孢子鏟到無菌水中，然后接種于一級種子罐中培養(yǎng)；接種后，所述一級種子罐的轉(zhuǎn)速為50-100rpm，通氣比為0.3-0.6，培養(yǎng)周期為35-40小時；

其中，所述一級種子罐為500L體積；

所述培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸鈉5.4g/L，磷酸氫二銨0.6g/L，消毒前調(diào)節(jié)pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分鐘；

( 1.3) 二級種子罐

當一級種子罐的菌濃達到3％時，將一級種子罐中的培養(yǎng)液移入二級種子罐，二級種子罐接種量為10-20v/v％；移完后，所述二級種子罐轉(zhuǎn)速30-50rpm，通氣比為0.3-0.6，周期20-25h；二級種子罐規(guī)格為3噸，培養(yǎng)基組分為葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸鈉5.4g/L，磷酸氫二銨0.6g/L，消毒前調(diào)節(jié)pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分鐘；

( 2) .將步驟1得到的種子置于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；

當二級種子罐菌濃達到5％時移入轉(zhuǎn)化罐中，接種量為10-20v/v％,轉(zhuǎn)化罐規(guī)格為15噸；

移完種子后，轉(zhuǎn)化罐的初始轉(zhuǎn)速為30rpm，風量為200m³/h，罐壓為0.05MPa，標定溶氧電極為100％，培養(yǎng)溫度為28℃；

隨著種子的生長，轉(zhuǎn)化罐中溶氧逐漸降低，保持風量不變逐漸提高轉(zhuǎn)速使溶氧保持在20-30％，種子生長大約20-25h，發(fā)酵液中葡萄糖降低到5g/L以下時準備進行第一次補料；

( 3) .將底物粉碎并使用50v/v％的乙醇水溶液打漿為膏體；

在1噸補料罐中投入150L乙醇和150L無菌水，攪拌均勻后投入200kg底物4-烯-3,17-雄甾二酮，夾套升溫到30-35℃，繼續(xù)攪拌使混合均勻；

底物使用前經(jīng)過氣流粉碎機粉碎，粒度在10-20μm；

( 4) .底物轉(zhuǎn)化

將混合好的底物緩慢補入轉(zhuǎn)化罐中，每次補充底物的量為轉(zhuǎn)化罐中發(fā)酵液體積的2v/v％，控制補充底物的速度，將補充底物的時間控制在4-5小時；

此時通過另外補充底物罐補入葡萄糖，使整個發(fā)酵過程中葡萄糖濃度在1-5g/L；

第一次補充底物后每隔4-8小時HPLC檢測轉(zhuǎn)化進程，當轉(zhuǎn)化率達到60-70％準備進行第二次；

( 5) .成品提取。