[發(fā)明專利]水稻miRNA-miR874基因及前體基因和在提高水稻對(duì)重金屬脅迫耐受性中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611044365.X
• 申請(qǐng)日: 2016-11-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106754913B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁艷菲;朱誠(chéng);孫駿威;王飛娟;蔣晗;江瓊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/11;C12N15/82;C12N1/21;A01H5/00;C12Q1/6895
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王靜

本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，尤其涉及水稻miRNA?miR874基因及其前體基因和其在提高水稻對(duì)重金屬鎘脅迫耐受性中的應(yīng)用。本發(fā)明利用熒光定量PCR及生物信息學(xué)等方法，在水稻幼苗根中篩選得到一種新的miRNA—miR874。miR874基因上游的啟動(dòng)子區(qū)通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)存在重金屬響應(yīng)元件（TGCRCNC）。實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，miR874在鎘脅迫下表達(dá)受到顯著上調(diào)。本發(fā)明進(jìn)而通過(guò)包含所述水稻miRNA的前體基因連接到載體上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，篩選培養(yǎng)，獲得純合的水稻轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段發(fā)現(xiàn)該miRNA具有顯著提高水稻對(duì)鎘耐受性的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，尤其涉及水稻miRNA-miR874基因及其前體基因和其在提高水稻對(duì)重金屬鎘脅迫耐受性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來(lái)，隨著我國(guó)工業(yè)化和城市化進(jìn)程的不斷發(fā)展，重金屬(鎘、鉛、汞等)引起的土壤污染形勢(shì)日趨嚴(yán)峻，對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。據(jù)報(bào)道我國(guó)受重金屬污染的耕地近3億畝，約占全國(guó)農(nóng)田總數(shù)的1/6；全國(guó)每年因重金屬污染糧食達(dá)1200萬(wàn)噸，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)200億元(韓少華等，2011)。浙江省受三廢污染的耕地面積達(dá)33.33萬(wàn)公頃，占全省耕地總面積的20％以上，富陽(yáng)郊區(qū)及富春江沿岸某些地段因采礦和冶煉活動(dòng)引起的農(nóng)田污染面積達(dá)數(shù)千畝，紹興、諸暨、天臺(tái)、黃巖、溫州、建德等地也存在鉛鋅礦污染土壤。而且，由于重金屬在土壤中的存留時(shí)間短則數(shù)十年(如鎘)，長(zhǎng)則數(shù)萬(wàn)年(如鉛)，要徹底解決現(xiàn)有問(wèn)題并非易事。因此，如何在輕度重金屬污染的土壤中進(jìn)行農(nóng)作物的安全生產(chǎn)，如何利用植物進(jìn)行大規(guī)模污染土壤的修復(fù)，這對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品安全、生態(tài)安全和人民健康，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。

目前對(duì)植物重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒機(jī)制的研究主要集中在植物螯合肽(Phytochelatin，PC)、金屬硫蛋白(MT)、陽(yáng)離子/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CAX2等。但這些基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制并不清楚。MicroRNA(miRNA)是一類單鏈、長(zhǎng)度約為20-24nt的內(nèi)源性RNA，對(duì)特定基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)具有重要調(diào)控作用。植物中，miRNA調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，并參與多種生物(病原微生物)和非生物脅迫(鹽脅迫、冷脅迫、干旱及重金屬等)應(yīng)答。近年來(lái)的研究表明，miRNA在植物重金屬脅迫響應(yīng)過(guò)程中扮演著重要角色。甘藍(lán)型油菜中，miR156、miR171、miR393以及miR396a的表達(dá)受鎘的抑制(Xie,F.L.,Huang,S.Q.,Guo,K.,Xiang,A.L.,Zhu,Y.Y.,Nie,L.,Yang,Z.M.Computational identification of novel microRNAs andtargets in Brassica napus.FEBS Lett,2007,581:1464–1474.)。蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表達(dá)可受鎘、汞、鋁的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)(Zhao,S.Z.,Si,Q.H.,Zhi,M.Y.Bioinformaticidentification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula.Biochem.Biophys.Res.Commun,2008,374:538–542.)。Huang等(2009)構(gòu)建鎘脅迫下水稻幼苗的small RNA文庫(kù)，克隆了19個(gè)新的miRNA，并發(fā)現(xiàn)其中多數(shù)miRNA在鎘脅迫下表達(dá)發(fā)生變化。如水稻幼苗根中miR604在鎘處理下表達(dá)下調(diào)，其靶基因脂轉(zhuǎn)移蛋白表達(dá)上升。而脂轉(zhuǎn)移蛋白參與植物多種抗逆性反應(yīng)并介導(dǎo)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程(Huang,S.Q.,Peng,J.,Qiu,C.X.,Yang,Z.M.Heavy metal-regulated new microRNAs fromrice.J.Inorg.Biochem,2009,103:282e287.)。Zhou等(2012)利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了苜蓿中52個(gè)新的汞脅迫相關(guān)的miRNA(Zhou,Z.S.,Zeng,H.Q.,Liu,Z.P.,Yang,Z.M.Genome ‐wide identification of Medicago truncatula microRNAs and theirtargets reveals their differential regulation by heavy metal.Plant CellEnviron,2012,35:86-99)。