[發明專利]血清miRNA?4463作為肝細胞癌的診斷標志物的應用

在審

• 申請號: 201611044244.5
• 申請日: 2016-11-24
• 公開（公告）號: CN107860751A
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 左建宏;文美玲;胡甜
• 申請（專利權）人: 南華大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 北京卓恒知識產權代理事務所(特殊普通合伙)11394
• 代理人: 唐曙暉,梁嬌旸

技術領域

本發明涉及血清microRNA(miRNA-4463)作為肝細胞癌的診斷標志物的應用，屬于生物技術和醫學領域。

背景技術

原發性肝癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，其高居癌癥相關死亡腫瘤的世界第三位。具有惡性程度高、轉移率高、復發率高及生存率低的流行病學特點。嚴重危害人們生命健康，成為威脅人類公共衛生的巨大挑戰。由于肝癌的早期臨床表現隱匿和缺乏有效的早期診斷，大部分患者診斷時都為晚期肝癌，常伴有遠處轉移或肝內轉移，其預后差，生存期短。因此早期發現和診斷對于及時采取有效的治療手段，改善患者預后，延長生存期具有重要的意義。

甲胎蛋白(AFP)是目前使用最為廣泛的診斷肝癌的腫瘤標志物，但是AFP仍存在診斷誤區，例如部分肝癌患者的AFP呈陰性或輕度升高。并且在其他肝臟疾病例如肝炎、肝硬化中，AFP同樣也會升高。

血清循環microRNA是一類單鏈，內源性非編碼小分子RNA。研究表明miRNAs參與了疾病的發生發展、復發及轉移。miRNA的表達紊亂是導致包括肝癌在內的一系列腫瘤形成的重要因素。miRNAs更早、更穩定的在體液或組織中表達，即使經過高溫、極酸或極堿性條件下，血漿中miRNAs的含量變化不大，甚至是經過多次凍融循環，其同樣能保持相對穩定。同時血清microRNA的檢測方法具有無創性、非侵入性，不會增加患者的身體以及經濟負擔。

大量研究證實miRNAs對于包括肝癌在內的許多疾病的發生、發展、增殖及轉移等多個生物學過程都起到了一定的作用。目前關于肝癌血清中循環microRNA的大量研究，也證明了其對于肝癌的診斷、轉移以及預后的關系。

綜上，血清microRNA是一種理想的肝癌診斷標志物。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種應用血清microRNA作為肝癌診斷標志物及預后判斷的新方法。

本發明利用microRNA表達譜芯片技術，分別比較肝癌患者和正常人血清microRNA表達譜，篩選得到了表達水平具有明顯差異的關鍵microRNA。在此基礎上，利用Real-time PCR技術分別檢測肝癌患者及正常人血清中關鍵microRNA的表達水平，隨后采用SPSS 18.0軟件(IBM,Chicago,IL)分析發現：肝癌患者血清中miRNA-4463的表達水平明顯高于正常人。而且對于低甲胎蛋白型肝癌(AFP<400ug/l)，其miRNA-4463表達水平較正常人也明顯升高。因此，miRNA-4463可以作為肝細胞癌的診斷標志物。同時對于低AFP的患者，檢測miRNA-4463的表達水平，對于診斷肝癌具有更大的指導價值。

具體而言，本發明是通過以下技術方案實現的：

1.miRNA-4463作為肝細胞癌的診斷標志物或在制備肝癌診斷試劑中的用途，所述miRNA-4463的堿基序列為GAGACUGGGGUGGGGCC。

2.一種檢測血清樣本中miRNA-4463的表達水平的方法，該方法包括：

A、取血清樣本，提取RNA；

B、以提取的RNA為模板，進行cDNA的合成；

C、使用特異性引物QIAGEN 218300-MS00044996、miR-39引物QIAGEN218300-MS00019789和上述cDNA，進行RT-PCR反應，獲得待測血清標本中microRNA-4463的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數；

D、根據公式(ΔCT＝CT _{miR-miRNA-4463}–CT _reference)，根據得到的CT值減去內參的CT值，得到該被檢測者miRNA-4463的表達水平，

其中CT _{miR-miRNA-4463}是指肝癌患者血清標本中microRNA-4463的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數，CT _reference是指內參miR-39的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。