[發明專利]一種高通量體液蛋白質樣品預處理裝置及其應用

在審

• 申請號: 201611043531.4
• 申請日: 2016-11-21
• 公開（公告）號: CN108088933A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 張麗華;袁輝明;戴忠鵬;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種高通量體液蛋白質樣品預處理裝置，是一種集體液(血漿，血清，尿液)高豐度蛋白質去除，中低豐度蛋白質在線變性和還原、除鹽以及在線酶解的系統，包括：體液高豐度蛋白質去除抗體柱，集束式高溫變性和還原器，集束式溶劑置換器以及固定化酶反應器。體液蛋白質樣品首先通過抗體柱去除高豐度蛋白質，然后洗脫下來的中低豐度蛋白質再通過集束式高溫變性和還原器實現在線、快速變性和還原，通過集束式溶劑置換器將變性劑和還原劑去除，最后通過固定化酶反應器在線酶解，酶解產生的肽段可以通過質譜進行檢測。本發明的優點是將體液蛋白質的復雜樣品預處理過程進行了集成化。

技術領域

本發明涉及一種高通量體液蛋白質樣品預處理裝置，是一種集體液高豐度蛋白質去除，中低豐度蛋白質在線變性和還原、除鹽以及蛋白質酶解的樣品預處理系統。

背景技術

由于體液(血漿、血清以及尿液等)中的蛋白質可以提供大量與生理、病理密切相關的信息，因此體液蛋白質組研究已成為揭示疾病的發病機制、實現早期診斷、分型及個體化治療等的重要手段。

由于體液中蛋白質的來源廣泛(各種細胞、組織和器官)、種類和數量繁多(數萬種以上)、豐度動態范圍寬(超過10個數量級)，因此，首要解決的問題就是減少體液中高豐度蛋白質對低豐度蛋白質檢測的干擾。

此外，臨床提供的可開展基礎研究的體液樣品量非常有限。目前體液蛋白質組樣品的處理通常采用離線多步的方式，實現蛋白質的變性、還原、烷基化、酶解和除鹽。不僅費時費力，而且會引起蛋白質樣品的損失和污染，進而影響定量分析的準確度、靈敏度和分析通量。因此亟需發展高效的體液蛋白質組樣品預處理新方法。

針對傳統樣品預處理方法存在的問題，我們發展了一種集體液高豐度蛋白質去除，中低豐度蛋白在線變性、還原、除鹽以及在線酶解的樣品預處理系統。該系統可以實現高通量、低損失的體液中低豐度蛋白質樣品預處理，在蛋白質組學研究中具有很好的應用前景。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種集蛋白質變性、還原、除鹽以及在線酶解于一體的樣品預處理系統。該系統可以直接處理體液蛋白質，不需要復雜和繁瑣的手工操作，同時整個處理過程保持高度的連續性和高通量性。

為了實現該目的，本發明的技術方案是：

1、采用2根以上中空纖維膜作為體液中低豐度蛋白質的傳輸載體，并固定于變性和還原反應腔體中，通過液相色譜泵或蠕動泵將高濃度變性劑和還原劑輸送至變性和還原反應腔體，并與蛋白質充分混合，在溫控系統作用下加熱并完成變性還原反應，其中變性劑的種類可以為鹽酸胍或尿素，濃度為4-8M，蛋白質還原劑的種類可以為二硫蘇糖醇、硫醇、三(2-羧乙基)膦，濃度為5-100mM，液相色譜泵或蠕動泵的流量范圍0.1mL/min-5mL/min，溫控裝置的加熱溫度范圍60-95℃；

2、采用2根以上中空纖維膜作為體液中低豐度蛋白質傳輸載體，并固定于緩沖液置換腔體中，通過液相色譜泵或蠕動泵將低濃度弱堿性緩沖溶液輸送至緩沖液置換腔體，使蛋白質溶劑與交換液發生置換，從而達到蛋白質除鹽的目的，其中低濃度堿性緩沖溶液可以為碳酸氫銨或醋酸銨溶液，濃度范圍為10-100mM,pH范圍為7.5-8.5，液相色譜泵或蠕動泵的流量范圍0.1mL/min-5mL/min；

3、酶反應器的基質材料為10-30μm粒徑的硅膠顆粒材料；蛋白酶通過共價鍵合附的方式固定在材料表面，所述酶為胰蛋白酶，酶液濃度范圍為10-50mg/mL；

4、將集束式高溫變性和還原器，溶劑置換器和酶反應器依次串聯構成集束式蛋白質樣品預處理裝置，具體為高溫變性和還原器上的中空纖維膜的物料流出端與溶劑置換器上的中空纖維膜的物料流入端相連通；溶劑置換器上的中空纖維膜的物料流出端與酶反應器的物料入口相連；