[發(fā)明專利]活細胞傳感儀在植物細胞低溫保藏中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611041562.6
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN108077241B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發(fā)明（設計）人: 郭美錦;李佳瑞;王澤建;陳雨霞;莊英萍;宋云飛;黃帥
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;G01N27/22
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明涉及活細胞傳感儀在植物細胞低溫保藏中的應用。首次將活細胞傳感儀作為一種快速評價細胞凍存效果的方法，通過細胞冷凍和復蘇前后活細胞電容值的變化來評價冷凍保護劑對細胞保存的效果。采用活細胞電極則可以快速、準確地表征活細胞的濃度。將活細胞電容值與2,3,4?氯化三苯基四氮唑(TTC)的檢測結果結合，可達到快速定量評價冷凍方法對細胞保存的效果，克服了以往植物細胞保藏方法的低效性和無定量性。本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法相比，細胞低溫保藏綜合得分可以提高5倍或以上。

技術領域

本發(fā)明屬于細胞檢測領域，更具體地，本發(fā)明涉及活細胞傳感儀在植物細胞低溫保藏中的應用。

背景技術

現有的植物細胞系的保種主要通過以下兩種方式。第一種是在生長培養(yǎng)基中進行繼代保存，另一種則是對細胞進行低溫冷凍保藏。通過長期繼代而保存細胞存在費時費力、成本昂貴，并且會出現植物細胞特性消失等缺點。而細胞在超低溫的條件下時，會停止內部的一系列代謝活動，并能夠保持細胞自身的特性，大大降低細胞特性消失的風險。而植物細胞超低溫保藏中，冷凍保藏的方法則對于細胞能夠保存成功起到決定性作用。由于植物細胞中含有大量的水分，給冷凍保存帶來困難。因此需要選擇適合的冷凍保護劑，以及優(yōu)化適合的冷凍保存方法，以最有效地控制細胞內含水以及冷凍過程中對細胞的損傷，以期可以在細胞冷凍保存后獲得更高的細胞活性。

植物細胞在冷凍保藏過程中會由于內部或者外部水結成冰晶而造成細胞破裂，以往，均是采用細胞線粒體活性測定的方法來間接反映細胞在冷凍保藏后的活性情況。但是，這種測定操作煩瑣，處理條件復雜，耗時長，在實際操作存在困難。

活細胞傳感儀是利用電容法測量細胞溶液中的活細胞濃度。細胞溶液中存在的交變電場會使其中的離子發(fā)生遷移，而活細胞具有完整的絕緣性細胞膜，其中的離子受到束縛導致細胞膜極化，這使得細胞成為一個個微小的電容器。測量得到的電容值與溶液中的細胞量存在良好的線性關系。目前活細胞傳感儀常被應用于發(fā)酵過程中測定發(fā)酵液中細胞量，尚未被應用于細胞冷凍保存中。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供活細胞傳感儀在植物細胞低溫保藏中的應用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種提高冷凍保存細胞的細胞活力的方法，所述方法包括：

(1)用0.15～0.3M蔗糖作為預處理劑對處于對數生長期的植物細胞進行預處理；

(2)將細胞加入到含有冷凍保護劑的培養(yǎng)基中，進行低溫保存；所述的冷凍保護劑為DMSO和蔗糖，在培養(yǎng)基中的終濃度為：

DMSO：8～12％(w/v)；更佳地為9～11％(w/v)；

蔗糖：8～12％(w/v)；更佳地為9～11％(w/v)。

在一個優(yōu)選例中，所述方法的步驟(1)中，還包括：對預處理后的細胞測定并記錄電容值A₁；

步驟(2)中，冷凍保存后，還包括：對植物細胞進行細胞復蘇，利用活細胞傳感儀測定并記錄電容值A₂；

以細胞的基礎電容值為A₃；以式(I)獲得細胞活力保存率：

細胞活力保存率＝(A₂-A₁)/(A₃-A₁) (I)；

根據獲得的細胞活力保存率，評價植物細胞的細胞活力。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物細胞是羅漢果植物細胞；較佳地是羅漢果愈傷組織細胞。

在另一優(yōu)選例中，所述方法的步驟(1)中，所述的蔗糖存在于液體培養(yǎng)基中，將處于對數生長期的植物細胞加入到液體培養(yǎng)基中，進行預處理。