[發明專利]一種人原代結腸癌細胞的分離及培養方法

在審

• 申請號: 201611033351.8
• 申請日: 2016-11-15
• 公開（公告）號: CN108070561A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人原代結腸癌細胞的分離及培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)無菌條件下切取新鮮結腸癌組織，4℃密封運回實驗室；

(2)將組織處理器械浸泡于濃度75％乙醇水溶液，再置于無菌操作臺紫外滅菌30min，將器械取出，在無菌操作臺里晾干；

(3)將組織放入預冷無菌含雙抗PBS液中，培養皿置于冰上洗滌除去表面的系膜、血管、脂肪、壞死組織，無菌條件下在預冷的PBS中用眼科剪將結腸癌組織剪成1mm×1mm×1mm的碎塊；

(4)用37℃預熱的胰蛋白酶-EDTA消化液和膠原酶分別消化；

(5)用含胎牛血清、雙抗、胰島素的混合培養基(簡稱混合培養基)終止消化，所得濾液250～350g離心5min，去掉上清液，保留沉淀，重復兩次；

(6)取細胞濾液用錐蟲藍染色檢測細胞活性；

(7)加入完全培養基重懸，細胞計數板計數；

(8)細胞計數后接種細胞至鋪多聚賴氨酸包被的的培養瓶中，置于37℃、5％CO2環境中繼續培養，每2～3d換一次液；

(9)細胞純化：酶消化法；

(10)細胞傳代培養；

(11)細胞形態及生長情況觀察；

(12)細胞免疫學鑒定。

2.根據權利要求1所述的人結腸癌細胞的分離及培養方法，其特征在于所用預冷的PBS濃度為0.01M，PH為7.2～7.4。

3.根據權利要求1所述的人結腸癌細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(4)所述消化環境為37℃，5％CO2培養箱，用0.2％～0.3％的胰蛋白酶消化5～15min，再用0.1％～0.2％的iv型膠原酶消化3～4h。

4.根據權利要求3所述的人結腸癌細胞的分離及培養方法，其特征在于所述0.25％的胰蛋白酶消化液消化10min，再用含0.1％的iv型膠原酶消化3.5min。

5.根據權利要求4所述的人結腸癌細胞的分離及培養方法，其特征在于所述的0.25％的胰蛋白酶含有0.01％的二乙烯四乙酸二鈉(EDTANa2)。

6.根據權利要求1所述的人結腸癌細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(5)所述的培養基為含10％胎牛血清、含100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的雙抗、4～6μg/ml胰島素的DMEM/F12(1∶1)培養基，pH為7.4。

7.根據權利要求1所述的人結腸癌細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(8)所述的培養瓶用3～4μg/cm2的多聚賴氨酸包被，培養條件為37℃、5％CO2培養箱。

8.根據權利要求1所述的人結腸癌細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(9)所述的細胞純化方法為用0.25％胰蛋白酶消化純化。