[發明專利]一種小鼠小腸巨噬細胞分離及培養方法

在審

• 申請號: 201611032935.3
• 申請日: 2016-11-15
• 公開（公告）號: CN108070557A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種小鼠小腸巨噬細胞分離及培養方法，包括步驟：(a)腹腔注射戊巴比妥鈉處死小鼠，酒精消毒后迅速取出小腸，預冷PBS沖洗腸腔至流出液變清；(b)小腸縱向剖開，加入EDTA震蕩溫育；(c)靜置棄上清，加入混合酶液消化；(d)連續篩網過濾；(e)濾液經Ficoll分離，清洗2?3次；(f)完全混合培養基重懸細胞沉淀，接種于培養瓶中；(g)差速貼壁法獲得小腸巨噬細胞。本發明提供了一種簡單、高效、穩定的分離高活性、高純度的小腸巨噬細胞的方法。

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，具體涉及一種小鼠小腸巨噬細胞分離及培養方法。

背景技術

髓樣祖細胞分化的單核細胞遷移到血液中，循環若干天后，分布于腸組織，成為定居的巨噬細胞，即腸道巨噬細胞，主要存在于腸粘膜的派氏集合淋巴結(PP)中，是調節腸道免疫反應的主要細胞之一，能夠吞噬病原微生物、抵抗免疫刺激物，在固有免疫應答中發揮重要作用，是機體第一道防御機制的基礎。

發明內容

本發明的目的是建立一種簡單、高效、穩定的分離小腸巨噬細胞的方法。

為了解決上述所涉及到的問題，本發明采取如下方法獲得小鼠小腸巨噬細胞：

本發明提供一種小鼠小腸巨噬細胞分離及培養方法，包括步驟：(a)腹腔注射戊巴比妥鈉處死小鼠，酒精消毒后迅速取出小腸，預冷PBS沖洗腸腔至流出液變清；(b)小腸縱向剖開，加入EDTA震蕩溫育；(c)靜置棄上清，加入混合酶液消化；(d)連續篩網過濾；(e)濾液經Ficoll分離，清洗2-3次；(f)完全混合培養基重懸細胞沉淀，接種于培養瓶中；(g)差速貼壁法獲得小腸巨噬細胞。

可選的小鼠為6-8周齡，體重22-28g的雌性小鼠。

可選的EDTA的濃度為0.1％-0.15％。

可選的震蕩消化的時間45min-1h。

可選的混合酶液為1.5-2％膠原酶IA、2％-2.5％的IV型膠原酶和1.5％-2.5％的II型膠原酶和0.1％-0.15％的透明質酸酶，消化時間為50min-1h。

可選的連續篩網過濾的方法為，消化后的組織液依次經過100目、200目、400目篩網過濾。

可選的混合完全培養基為含5％FBS和5％FCS的DMEM/1640(1∶1)。

可選的差速貼壁的方法為混合完全培養基重懸接種后，培養2-4h后更換新鮮完全培養基。

本發明提供一種連續消化法結合差速貼壁法獲得小鼠小腸巨噬細胞的方法，操作簡便，耗時短。

附圖說明

圖1培養72h細胞圖片(200×)

具體實施方式

為了使本發明的目的及優勢更清新地展現，現將具體實施方式進一步闡述。此處所闡述的具體實施方式僅針對本發明進行解釋，并不用于限定本發明。

本發明選擇6-8周齡，體重22-28g的雌性小鼠，分離小腸巨噬細胞。具體操作如下：

1、脫頸的方法處死小鼠，75％酒精消毒，剪開腹部皮膚及腹膜，取出小腸，用含雙抗預冷的PBS沖洗小腸內容物至流出液變清；

2、將小腸縱向剖開，加入37℃預熱的含0.1％-0.15％EDTA的PBS緩沖液中，37℃水浴鍋中振蕩溫育45min-1h；

3、棄上清，剩余組織塊用混合消化酶，于37℃搖床水浴鍋中消化50min-1h，每15-20min吹打混勻一次，所述混合消化酶液為含1.5-2％膠原酶IA、2％-2.5％的IV型膠原酶和1.5％-2.5％的II型膠原酶和0.2％-0.25％的透明質酸酶；