[發明專利]小麥微衛星標記位點開發方法與微衛星標記位點內的微衛星標記的長度檢測方法

有效

• 申請號: 201611032452.3
• 申請日: 2016-11-16
• 公開（公告）號: CN106755314B
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 方治偉;周俊飛;李論;彭海
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

1.一種小麥微衛星標記位點開發方法，其特征在于，所述開發方法包括：

將n個具有多態性的小麥樣本等質量混合，獲得混合樣本，其中n＞1，選擇所述n個具有多態性的小麥樣本的方法包括：選擇外部形態不同的小麥樣本、生物分類不同的小麥樣本、標記互不相同的小麥樣本或不同生態區域的野生資源的小麥樣本；

提取所述混合樣本的基因組；

將所述混合樣本的基因組片段化，獲得基因組片段；

將多個具有簡單重復序列的探針作為探針組，利用所述探針組中的每個探針分別與所述基因組片段進行雜交，獲得多個雜交溶液，所述探針的數量為12個，每個所述探針的簡單重復序列中的重復單元為CT、GA、TG、AC、TA、TGT、CCA、ATC、CCT、AGA、ATG或CAA，每個所述探針的簡單重復序列的重復次數為6～20，對多個所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段分別進行純化，得到多個純化的雜交基因組片段；

將多個所述純化的雜交基因組片段等質量混合后，利用高通量測序檢測混合后的所述純化的雜交基因組片段，獲得第一高通量測序片段；

從所述第一高通量測序片段中，篩選有效的所述高通量測序片段，所述有效的高通量測序片段包括微衛星標記位點內的微衛星標記，所述有效的高通量測序片段中的所述微衛星標記的兩側序列的堿基數均≥1個，且所述有效的高通量測序片段中的所述微衛星標記中至少有一側的序列的堿基數≥10個；

根據所述有效的高通量測序片段中的微衛星標記的兩側序列的同源性對所述有效的高通量測序片段進行分類，同一類的所述有效的高通量測序片段為同一個微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段，若同一個所述微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段的條數≥α1，則成功開發一個所述微衛星標記位點，其中，α1為第一判定閾值且α1≥(高通測序深度×有效的高通量測序片段的比例/基因組上能檢測到的微衛星標記位點數)×概率保證。

2.根據權利要求1所述的開發方法，其特征在于，α1≥20。

3.根據權利要求1所述的開發方法，其特征在于，每個所述探針的簡單重復序列的重復次數為6～15。

4.根據權利要求1所述的開發方法，其特征在于，所述探針的序列如序列表中SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:12所示。

5.一種權利要求1-4任一項所述的開發方法成功開發的微衛星標記位點內的微衛星標記的長度檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括：

從成功開發的所述微衛星標記位點中，選擇待檢測的微衛星標記位點，所述從成功開發的所述微衛星標記位點中，選擇待檢測的微衛星標記位點的方法包括：

選擇所述待檢測的微衛星標記位點的標準為H值最大的所述微衛星標記位點，其中，H值為所述微衛星標記位點的多態性指數，其中，S為微衛星標記位點按有效的高通量測序片段中的微衛星標記的長度分類的數目，i為按所述微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段中的微衛星標記的長度進行分類時，第i個類別，i為自然數；ai為第i個類別的有效的高通量測序片段的數目占總的有效的高通量測序片段的數目的比例，利用多重擴增引物擴增所述待檢測的微衛星標記位點內的微衛星標記，得到擴增產物，將所述擴增產物進行高通量測序，得到第二高通量測序片段，通過分析所述第二高通量測序片段，獲得所述微衛星標記位點內的微衛星標記的長度，獲得所述微衛星標記位點內的所述微衛星標記的長度的方法為：去除所述第二高通量測序片段中的所述微衛星標記后，獲得所述第二高通量測序片段的左邊界序列和所述第二高通量測序片段的右邊界序列；利用所述左邊界序列和所述右邊界序列將所述第二高通量測序片段中的每個片段比對到所述待檢測的微衛星標記位點上；截取每一個所述待檢測的微衛星標記位點的所述第二高通量測序片段中的所述微衛星標記；將獲得的所述微衛星標記按長度進行分類，并計算第i個類別的真實度R_i＝N_i/N_max，其中，i為按所述微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段中的微衛星標記的長度進行分類時，第i個類別，N_i為所述第i個類別的所述第二高通量測序片段的數量，N_max為所有類別的所述第二高通量測序片段的數量的最大值；若所述真實度R_i≥α4，則所述第i個類別的所述微衛星標記的長度為所述微衛星標記位點內的所述微衛星標記的長度，若所述真實度R_iα4，則所述第i個類別的微衛星標記的長度不為所述微衛星標記位點內的所述微衛星標記的長度，其中，α4為第四判定閾值且α4＝0.15；

制備所述多重擴增引物的方法包括：

從選擇的所述待檢測的微衛星標記位點的所有所述有效的高通量測序片段中，提取所述微衛星標記并挑選出最長的所述微衛星標記作為多重擴增引物的模版序列的微衛星標記；

從選擇的所述待檢測的微衛星標記位點的所有所述有效的高通量測序片段中，提取所述微衛星標記的左側序列并挑出長度大于α2個堿基的所有序列，從挑選出的所述所有序列中，挑選出頻率最高的序列，以所述頻率最高的序列作為參考序列，將所述參考序列與所有的所述微衛星標記的左側序列進行比對，在所述頻率最高的序列中獲得每一個堿基的覆蓋倍數和變異頻率；在所述頻率最高的序列中，將所述覆蓋倍數≤1/α3或所述變異頻率≥α3的堿基變為N后作為所述多重擴增引物的模板序列的左側序列，其中，N為A、T、C和G四種堿基中任意一種及以上的堿基；α2為第二判定閾值，α2＝(所述第一高通量測序片段的平均長度-所述多重擴增引物的微衛星標記位點的長度)÷2；α3為第三判定閾值，α3≥5×(1-所述第一高通量測序片段的準確度)；

按照與所述多重擴增引物的模板序列的左側序列相同的方法，獲得多重擴增引物序列的模板序列的右側序列；

將所述多重擴增引物的模板序列的左側序列、所述多重擴增引物的模板序列的微衛星標記和所述多重擴增引物的模板序列的右側序列依次連接，得到所述微衛星標記位點的多重擴增引物的模板序列，利用所述微衛星標記位點的多重擴增引物的模板序列，獲得所述多重擴增引物。