[發明專利]一種高特異性的胚系堿基突變PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201611032168.6
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN108103158A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 張樂橦;宋炎;劉磊;劉軍;朱紅梅;葉明芝
• 申請（專利權）人: 天津華大醫學檢驗所有限公司;深圳華大基因股份有限公司;廣州華大基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

本發明公開了一種高特異性的胚系堿基突變PCR檢測方法，包括：在無3’?5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸鹽存在的環境下，使用修飾引物進行PCR擴增，修飾引物的3’末端是雙脫氧核苷酸，該3’末端與胚系堿基突變位點野生型基因型一致而與突變型基因型不一致，在有胚系堿基突變位點野生型模板存在的情況下，DNA聚合酶依賴模板而焦磷酸解修飾引物的3’末端與模板互補的雙脫氧核苷酸，引物正常延伸，使用實時熒光定量PCR對樣本進行檢測，與內參基因的Ct值比較判斷樣本有無純合突變或雜合突變。本發明的方法能夠提高特異性和靈敏度，可針對胚系堿基突變，并可定量檢測基因頻率，解決了ASA?PCR假陽性導致基因頻率定量不準的問題。

技術領域

本發明涉及基因突變檢測技術領域，尤其涉及一種高特異性的胚系堿基突變PCR檢測方法。

背景技術

等位基因特異性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)利用的是堿基錯配不能擴增的原理，設計特異的正向引物和遠端反向引物，引物3’端與SNP的突變型基因型相同，因此只有突變型模板能被擴增，野生型模板無法擴增。

2000年，Liu和Sommer在AS-PCR基礎上進行改進，將引物3’端脫氧核苷酸dNMP更換為雙脫氧核苷酸ddNMP，使用無3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，只有3’末端與模板互補的引物發生焦磷酸解才能進行擴增，不互補的引物則無法擴增。這種擴增依賴焦磷酸解反應的激活，稱為焦磷酸解激活聚合反應(Pyrophosphorolysis-activated polymerization，簡稱PAP)。與傳統的AS-PCR相比，這一改進顯著增加了擴增的選擇性和特異性。

2006年，Liu和Sommer使用的聚合酶是在F667Y突變基礎上將N端刪除的Taq DNA聚合酶，這種酶被切除了5’-3’核酸外切酶結構，擴增產物突變錯配率是Taq DNA聚合酶的1/2，能夠準確地對引物3’端進行焦磷酸解反應。

目前堿基胚系突變檢測的常用方法包括測序和實時熒光定量PCR等，實時熒光定量PCR采用△△CT值法，設計與堿基突變野生型基因型一致的引物特異性擴增野生型模板，利用野生型模板和內參基因作為對照，樣本拷貝數與內參基因拷貝數的比值，與野生型基因拷貝數與其內參基因拷貝數的比值比較得出基因頻率，理論上，純合野生型基因該比值為100％，雜合突變比值為50％，純合突變該比值為0％。但是由于該方法所使用的酶具有矯正功能，因此一部分突變型模板也會擴增，導致檢測到的基因頻率偏高。

現有技術存在如下缺點：(1)假陽性，由于引物3’端不嚴格配對，因此PCR中引物3’末端與突變位點不匹配也可以發生非特異性擴增，導致假陽性，進而導致檢測到的基因頻率偏差大，準確率低；(2)二級結構，多對引物存在同一反應體系中易形成二級結構，尤其是引物3’端連續4bp有反向互補序列容易形成引物二聚體；(3)異質性，針對惡性腫瘤體細胞突變的檢測樣本DNA多采集自腫瘤組織，存在取樣位置不同產生的異質性問題。

發明內容

本發明能夠提高實時熒光定量PCR檢測胚系突變基因頻率的準確性，減少誤差，適合用于遺傳性腫瘤純合或雜合突變的檢測，為胚系堿基突變定量檢測提供一種特異性較高的新方法。

因此，本發明提供一種高特異性的胚系堿基突變PCR檢測方法，包括：在無3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸鹽存在的環境下，使用修飾引物進行PCR擴增，上述修飾引物的3’末端是雙脫氧核苷酸，該3’末端與胚系堿基突變位點野生型基因型一致而與突變型基因型不一致，在有胚系堿基突變位點野生型模板存在的情況下，上述DNA聚合酶依賴模板而焦磷酸解上述修飾引物的3’末端與模板互補的雙脫氧核苷酸，引物正常延伸，野生型模板被擴增，使用實時熒光定量PCR對樣本進行檢測，與內參基因的Ct值比較判斷樣本有無純合突變或雜合突變。