[發明專利]一種高特異性的堿基突變PCR檢測方法在審
| 申請號： | 201611032111.6 | 申請日： | 2016-11-22 |
| 公開（公告）號： | CN108103157A | 公開（公告）日： | 2018-06-01 |
| 發明（設計）人： | 張樂橦;宋炎;劉磊;劉軍;朱紅梅;葉明芝 | 申請（專利權）人： | 天津華大醫學檢驗所有限公司;深圳華大基因股份有限公司;廣州華大基因醫學檢驗所有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6858 | 分類號： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281 | 代理人： | 孫銀行;彭家恩 |
| 地址： | 300000 天津市天津自貿區（空港經*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 修飾引物 雙脫氧核苷酸 堿基突變 焦磷酸 檢測 實時熒光定量PCR 巢式PCR引物 突變型模板 外切酶活性 引物二聚體 非特異性 焦磷酸鹽 快速檢測 擴增曲線 巢式PCR 模板DNA 靈敏度 野生型 富集 堿基 條帶 引物 突變 延伸 記錄 | ||
1.一種高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述方法包括：首先對模板DNA進行巢式PCR富集；然后使用無3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶，在焦磷酸鹽存在的環境下，使用修飾引物進行PCR擴增，所述修飾引物在模板上對應的位置位于巢式PCR引物的內側，所述修飾引物的3’末端是雙脫氧核苷酸，該3’末端與待檢測突變型模板互補而不與正常野生型模板互補，在有待檢測突變型模板存在的情況下，所述DNA聚合酶依賴模板而焦磷酸解所述修飾引物的3’末端與模板互補的雙脫氧核苷酸，引物正常延伸，使用實時熒光定量PCR記錄擴增曲線，檢測Ct值差異。
2.根據權利要求1所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述修飾引物是預先合成的3’末端缺少所述雙脫氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脫氧核苷酸轉移酶和ddNTP的存在下，將雙脫氧核苷酸加到所述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。
3.根據權利要求1所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述模板DNA是基因組DNA。
4.根據權利要求1所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述堿基突變是替換、插入或缺失。
5.根據權利要求1所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述方法用于多種體液樣本的基因檢測。
6.根據權利要求5所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述多種體液樣本包括血漿、癌組織、腦脊液、胸腔積液、唾液、腹水、脫落細胞和淋巴液。
7.根據權利要求1所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述方法用于組織樣本的基因檢測。
8.根據權利要求1所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述方法用于惡性腫瘤相關體細胞突變的基因檢測。
9.根據權利要求1所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述修飾引物的5’端連接公共序列，所述PCR擴增之后利用所述公共序列進行大量擴增。
10.根據權利要求9所述的高特異性的堿基突變PCR檢測方法，其特征在于，所述公共序列中插入用于區別不同樣本的標簽序列，所述PCR擴增之后將來源于不同樣本的PCR擴增產物混庫進行高通量測序。
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