[發明專利]一種烏菜游離小孢子培養方法

在審

• 申請號: 201611031964.8
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN106718825A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 秦艷梅;方凌;張其安;王明霞;王艷;田紅梅;賈利;嚴從生;江海坤
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院園藝研究所
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H4/00
• 代理公司: 安徽省蚌埠博源專利商標事務所34113
• 代理人: 楊晉弘

1.一種烏菜游離小孢子培養方法，其特征在于，該方法包括下述步驟：

(1)選擇游離小孢子培養胚狀體誘導率較高的大白菜材料，與待培養的烏菜材料進行雜交，得雜交種子F1，為烏菜引入大白菜的遺傳物質；

(2)將萌動的雜交種子F1低溫春化后播種于穴盤，待3-4片真葉時，移栽至大田中，初花至盛花期，取適宜大小的花蕾進行游離小孢子培養，得再生植株。

2.根據權利要求1所述的一種烏菜游離小孢子培養方法，其特征在于，所述步驟(2)中游離小孢子培養步驟為：

取材：以F1作為材料，在初花至盛花期，于晴天上午8:00-10:00選取健壯無病蟲害植株上的花蕾，置于載玻片上，滴2滴蘇木精染液，用鑷子和解剖針破碎花蕾，去除萼片、花藥組織，蓋上蓋玻片，光學顯微鏡下觀察單核靠邊期小孢子，確定小孢子處于單核靠邊期比例較高時花蕾的大小，以此大小為標準進行取材；

消毒：將選取的花蕾放入25mL無菌小燒杯中，首先用70％的酒精7-10mL消毒30s，其次用2.5％的NaClO溶液約10mL消毒5min，然后用無菌水沖洗3次；

小孢子純化：消毒后，于上述小燒杯中加入蔗糖質量濃度為130g/L的B5無菌液體培養基約8mL，用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來，350目濾網過濾，收集濾液于15mL旋蓋離心管中，轉速1000rpm離心3min，棄上清，重復2次，最后加入蔗糖質量濃度為130g/L的NLN無菌液體培養基，使小孢子密度達到1×10⁵-2×10⁵個/mL，即獲得小孢子懸浮液；

培養：將小孢子懸浮液分裝于直徑6cm的培養皿中，每皿約3.5mL，用Parafilm封口膜密封后，立即置于33℃黑暗條件下培養24h；然后，轉入25℃黑暗條件下培養，有肉眼可見的胚出現時，將培養皿轉移到轉速60rpm的搖床上繼續暗培養至形成子葉型胚狀體；平均每個花蕾誘導出12.53個胚。

3.根據權利要求1所述的一種烏菜游離小孢子培養方法，其特征在于，所述步驟(2)中再生植株成苗步驟為：

暗培養20d形成子葉型胚狀體，挑選子葉型胚狀體轉接入添加30g/L蔗糖、8g/L瓊脂、pH5.8、116℃高溫高壓滅菌30min的MS培養基中，在25℃、光照14h/d條件下培養，形成再生植株；

將胚狀體萌發形成的幼苗接種到添加30g/L蔗糖、6g/L瓊脂、1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、pH5.8、116℃高溫高壓滅菌30min的MS生根培養基中，在25℃、光照14h/d條件下培養，獲得完整植株，擴繁、馴化移栽至田間。