[發明專利]一種基于藍光誘導的衣藻外源基因表達系統及其應用

有效

• 申請號: 201611028385.8
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN106591349B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 王玉婷;蔣欣芩;李輝;胡章立
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79
• 代理公司: 廣東深宏盾律師事務所 44364
• 代理人: 趙瓊花

本發明公開了一種基于藍光誘導的衣藻外源基因表達系統及其應用，所述表達系統的元件包括光受體隱花色素CRY2基因及其相互作用蛋白CIB1基因、GAL4的DNA結合結構域BD和具有轉錄激活活性單純皰疹病毒的激活域VP64、核定位序列NLS、能與GAL4轉錄因子DNA結合結構域BD結合的UAS序列、外源基因，其中CRY2?BD、CIB1?VP64?NLS、UAS?外源基因分別連接在一起，并通過遺傳轉化整合到衣藻的核基因組中。本發明以單色光?藍光作為誘導外源基因表達的誘導因素，克服了熱激誘導對藻細胞的傷害,也克服了各種化學誘導劑對藻細胞代謝的影響。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及利用藍光誘導的外源基因表達系統及其在衣藻基因表達調控和轉基因衣藻生物反應器中的應用。

背景技術

轉基因技術是二十世紀七十年代在大腸桿菌中最早發展起來的，隨著分子生物學的快速發展，外源基因的高效表達已經能為基因工程藥物及工農業原料等重要的生產途徑。藻類由于既具有微生物快速生長的特性又能通過光合作用合成目標產物，非常適合構建轉基因藻類生物反應器。

萊茵衣藻是少數三套基因組均能進行遺傳轉化的生物【Lumbreras, V., Purton,S., 1998. Recent advances in Chlamydomonas transgenics. Protist 149, 23–27】，其生長周期短，光合效率高，具有“光合酵母”之稱，能在短時間內獲得大量遺傳穩定的轉基因后代。然而，由于萊茵衣藻核基因組具有GC含量高（約62％）、密碼子高度偏愛等特點[Harris EH (1989) .The Chlamydomonas Source Book: A Comprehensive Guide toBiology and Laboratory Use. Academic Press,San Diego, California],盡管大量的萊茵衣藻外源基因表達系統已經報道，但這些系統均還存在一定的局限性。最早利用萊茵衣藻核遺傳系統進行轉化是利用nit1 基因來修復nit1基因突變株，（Kindle KL, SchnellRA, Fernandez E, Lefebvre PA. 1989. Stable nuclear transformation ofChlamydomonasusing the Chlamydomonasgene for nitrate reductase. J Cell Bioi109: 2589-2601），隨后使用SV40 和CaMV 35S啟動子在衣藻中表達基因的效率較低，甚至是出現“基因沉默”現象。采用內源的啟動子如RBCS2、NIT 可以使基因的表達水平得到大大的改善。Victoria Lumbreras等（1998）實驗表明，刪減RBCS2啟動子上游序列約440bp后可使ble化效率提高3倍，但不能提高ble基因的表達效率，可能是被刪除的序列里有負調節元件，影響了ble基因在基因組的插入和穩定【Lumbreras V., Stevens D. and Purton S.1998. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron. Plant J.14, 441-448】。RBCS2-HSP70是目前應用比較廣泛的啟動子，它是1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子與熱激蛋白70的嵌合型啟動子，在強光和熱激誘導的情況下，能高效誘導外源基因的表達【Chaogang Wang, Zhangli Hu,Anping Lei, Baohui Jin. Biosynthesis of poly-3-hydroxybutyrate (PHB) intransgenic green algae Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Phycology, 2010,46:396- 402.】，但無論是強光照射還是熱激處理都會嚴重影響藻細胞的生長狀態，且熱激處理不適宜大規模培養藻類的誘導處理。