[發明專利]一種誘導性多能干細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201611022788.1
• 申請日: 2016-11-17
• 公開（公告）號: CN108070563A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 孫廣煒;劉洋;劉揚;張英;趙姍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明公開了一種誘導性多能干細胞的制備方法，該方法構建了含有小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c?Myc四種基因的慢病毒及其激活慢病毒，并使用這兩種慢病毒感染人外周血單核細胞來獲得誘導性多能干細胞(iPSCs)，具體包括下列步驟：(1)人外周血單核細胞的分離與培養；(2)質粒的構建和擴增；(3)慢病毒的構建；(4)慢病毒感染人外周血單核細胞以及iPSCs的獲得。本發明將小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c?Myc四種轉錄因子整合到一個質粒上，進而構建了同時含有這四種基因的慢病毒及其激活慢病毒，利用這兩種病毒可使得人外周血單核細胞成為iPSCs。與使用多個含有單個基因病毒的常規iPSCs制備方法相比，本方法減少了所需要病毒的數量，大大簡化了慢病毒的制備步驟，并降低了污染的風險。

技術領域

本技術涉及一種誘導性多能干細胞的制備方法，特別涉及一種利用同時具有四種基因的慢病毒及其激活病毒進行細胞轉染以制備誘導性多能干細胞的方法。

背景技術

誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是2006年日本科學家山中伸彌首次利用逆轉錄病毒載體將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四個轉錄因子導入小鼠皮膚成纖維細胞中，使其重編程所獲得的一種多能性干細胞。iPSCs在形態、基因及蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等均與胚胎干細胞極為相似。2007年山中伸彌和美國湯普森實驗室都報道，利用幾種特定的轉錄因子可以誘導人皮膚成纖維細胞成為iPSCs。兩個實驗室采用了不同的誘導方案，山中伸彌實驗室使用逆轉錄病毒引入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四種因子組合，而湯普森實驗室使用慢病毒載體引入Oct4、Sox2加Nanog和LIN28這種因子組合。逆轉錄病毒只能轉導分裂期細胞，而慢病毒載體可以感染非分裂期細胞，容納外源性目的基因片斷大、免疫反應小等特點，因而應用廣泛。十年來，盡管新型轉染載體不斷出現，如腺病毒、脂質體、小分子等，然而慢病毒轉染的效率仍然是最高的，大量的基礎研究和應用技術研發依然是基于慢病毒轉染方法。

由于制備iPSCs需要使用多種因子的組合，常規的感染方法是，首先分別構建含有單一基因的質粒，之后分別包裝成含有單一基因的慢病毒，接下來將各個含有單一基因的慢病毒進行混合，最后使用混合病毒液感染目的細胞。這種常規慢病毒感染方法需要制備多個含有單一基因的慢病毒，步驟繁瑣，耗時長，且多次重復操作造成污染幾率增加。

針對上述常規慢病毒制備iPSCs方法所存在的關鍵問題，迫切需要進一步優化iPSCs制備技術。本發明開發了一種新的制備誘導性多能干細胞的方法，即構建同時含有四種基因的慢病毒及其激活病毒，使用這兩種病毒來感染人外周血單核細胞，從而得到iPSCs。此新方法減少了所需病毒的數量，大大簡化了慢病毒的制備過程，進一步提高了iPSCs制備過程的效率，大大降低了污染的風險。

發明內容

本發明的目的在于提供一種誘導性多能干細胞的制備方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案包括下列步驟：

(1)人外周血單核細胞的分離與培養

利用Ficoll淋巴細胞分離液分離人外周血單核細胞，使用含有生長因子的外周血單核細胞培養液培養4-7天；

(2)質粒的構建和擴增

構建Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號四種質粒，將所構建好的質粒分別取上清液做轉化，用5-alpha大腸桿菌感受態或NEB感受態或C2987H感受態進行轉化，均使用氨芐青霉素抗性的固體培養基；次日挑取克隆置于氨芐青霉素的液體培養基中擴增，用質粒提取試劑盒提取質粒；

所述Ⅰ號質粒為psPAX2s質粒，此質粒是第二代慢病毒包裝質粒，在原核生物中具有氨芐青霉素抗性；

所述Ⅱ號質粒為pMD2.G質粒，此質粒是水泡性口炎病毒包膜質粒，在原核生物中具有氨芐青霉素抗性；