[發(fā)明專利]體外檢測(cè)腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的方法、試劑盒以及腫瘤疫苗

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611022501.5
• 申請(qǐng)日: 2016-11-15
• 公開（公告）號(hào): CN106645677B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓研妍;梁小玲;陳錫和;馬民駿;唐龍清;周向軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 恒瑞源正（上海）生物科技有限公司;恒瑞源正（廣州）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N33/50;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 深圳市順天達(dá)專利商標(biāo)代理有限公司 44217
• 代理人: 鄒秋菊

1.一種非診斷目的的體外檢測(cè)腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的方法，其特征在于，包括：

S1、在外周血單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入腫瘤新生抗原刺激并進(jìn)行培養(yǎng)孵育；

S2、采用IFNγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)識(shí)別所述腫瘤新生抗原的腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞；

其中所述腫瘤新生抗原包括序列為L(zhǎng)SKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列為KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷目的的體外檢測(cè)腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟S1包括：

S11、采用抗原預(yù)測(cè)軟件netMHC4設(shè)計(jì)所述腫瘤新生抗原；

S12、在懸浮所述外周血單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入所述腫瘤新生抗原進(jìn)行預(yù)刺激并進(jìn)行培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的體外檢測(cè)腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟S11包括：

S111、取離體腫瘤組織做基因分析，以找出非同義的基因突變位點(diǎn)；

S112、采用抗原預(yù)測(cè)軟件netMHC4基于包含所述非同義基因突變位點(diǎn)的抗原與相應(yīng)的主要組織相容性分子的結(jié)合能力選擇結(jié)合能力最好的抗原肽序列；

S113、采用抗原預(yù)測(cè)軟件netMHC4從所述抗原肽序列中選擇出其與相應(yīng)的主要組織相容性分子的結(jié)合能力明顯高于其對(duì)應(yīng)的非基因突變位點(diǎn)與相應(yīng)的主要組織相容性分子的結(jié)合能力的抗原肽序列作為所述腫瘤新生抗原。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的體外檢測(cè)腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟S12包括：

S121、將所述外周血單個(gè)核細(xì)胞在無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮，并加入所述腫瘤新生抗原進(jìn)行預(yù)刺激；

S122、在常溫含CO₂的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非診斷目的的體外檢測(cè)腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟S2包括

S21、將預(yù)刺激后的所述外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包被有IFNγ抗體的容器內(nèi)，加入所述腫瘤新生抗原進(jìn)行孵育，從而使得受到所述腫瘤新生抗原刺激后的腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞分泌IFNγ；

S22、所述IFNγ抗體捕獲所述IFNγ，且通過酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生新生肉眼可見的免疫斑點(diǎn)；

S23、統(tǒng)計(jì)所述免疫斑點(diǎn)的數(shù)量，以基于所述免疫斑點(diǎn)的數(shù)量檢測(cè)所述腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非診斷目的的體外檢測(cè)腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟S21進(jìn)一步包括：

S211、采用乙醇水溶液在常溫下潤(rùn)濕Elispot板，隨后采用PBS清洗所述Elispot板；

S212、加IFNγ抗體以包被所述Elispot板，然后加板蓋低溫孵育過夜，隨后用PBS清洗后加封閉液封閉所述IFNγ抗體未結(jié)合的位置，加板蓋常溫孵育；

S213、調(diào)整所述無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中的預(yù)刺激后的所述外周血單個(gè)核細(xì)胞的濃度后，隨后加入相應(yīng)的所述腫瘤新生抗原形成混合無血清細(xì)胞培養(yǎng)液；

S214、將所述混合無血清細(xì)胞培養(yǎng)液加入到包被好的所述Elispot板的板孔中，加蓋板在常溫含CO₂的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的非診斷目的的體外檢測(cè)腫瘤新生抗原特異性T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟S22進(jìn)一步包括：

S221、棄除所述無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，然后采用PBS進(jìn)行清洗，隨后采用清洗液進(jìn)行清洗；

S222、隨后加入生物素偶聯(lián)的IFNγ識(shí)別抗體，常溫孵育；

S223、采用清洗液進(jìn)行清洗，然后加入偶聯(lián)鏈酶親和素的辣根過氧化物酶，加板蓋進(jìn)行常溫孵育；

S224、采用清洗液進(jìn)行清洗，然后加入辣根過氧化物酶的底物，室溫避光，然后采用清洗液充分清洗，晾干。