[發明專利]一種萊茵衣藻重金屬鎘吸附突變體的篩選方法

在審

• 申請號: 201611022254.9
• 申請日: 2016-11-16
• 公開（公告）號: CN106967749A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 陳斌;李麗麗;胡長峰
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12Q1/68;C12R1/89
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所11302
• 代理人: 房德權

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種萊茵衣藻重金屬鎘吸附突變體的篩選方法。

背景技術

隨著重工業化的不斷發展，國內重金屬污染問題也日益加重。大量的重金屬進入大氣、水、土壤之后，將會打破自然的生態平衡。同時通過水循環、大氣循環、以及食物鏈等，重金屬最終會在我們人體中富集，威脅到人類的身體健康。重金屬污染與其他環境污染物不同，重金屬污染很難在環境中自然降解，因此，如何將重金屬從環境中富集回收，是解決重金屬污染問題的關鍵所在。

在眾多重金屬污染中，鎘污染情況最為嚴重。工業廢氣是鎘污染的主要來源，通過降雨，大氣中的鎘便會積累在土壤中。由于電鍍，采礦等工業廢水的排放，灌溉水也被污染，進而累積到了土壤中。再者農田中施用的一些含鎘的化肥，這些也會污染土壤?，F有技術中通常采用物理化學方法對污水中的鎘進行處理，常用方法有沉淀法、吸附法、高分子捕集劑法、離子交換法等等，但是極易造成二次污染。

萊茵衣藻是一種單細胞真核生物，具有吸附重金屬的能力。衣藻吸附重金屬過程主要分為生物吸附和生物累積，前者是細胞壁物理吸附過程，后者則是細胞生理代謝的累積過程。相對于傳統的廢水處理方法而言，衣藻具有環保、經濟和高效等優點。

發明內容

本發明提供一種萊茵衣藻重金屬鎘吸附突變體的篩選方法，基于上述技術問題，達到了提供能夠簡單、高效地獲得大量的衣藻重金屬鎘吸附突變體技術效果。

為解決上述技術問題，本發明提供一種萊茵衣藻重金屬鎘吸附突變體的篩選方法，所述篩選方法包括：

根據不同氯化鎘濃度對萊茵衣藻生長的影響，選擇合適的重金屬鎘吸附突變體篩選濃度；

電擊轉化獲得萊茵衣藻突變體；

篩選出萊茵衣藻重金屬鎘吸附突變體；所述篩選出萊茵衣藻重金屬鎘吸附突變體，包括：篩選重金屬鎘敏感型突變體和篩選重金屬鎘抗性突變體；

鑒定篩選出的萊茵衣藻重金屬鎘吸附突變體的突變基因。

優選的，所述根據不同氯化鎘濃度對萊茵衣藻生長的影響，選擇合適的重金屬鎘吸附突變體篩選濃度，包括：

培養萊茵衣藻；

配置固體TAgP氯化鎘濃度呈梯度的培養基；

將培養好的萊茵衣藻分別置于所述固體TAgP氯化鎘濃度呈梯度的培養基中，根據萊茵衣藻在不同濃度呈梯度的培養基中的生長狀況，選擇重金屬鎘敏感型突變體篩選濃度和重金屬鎘抗性突變體篩選濃度。

優選的，所述配置固體TAgP氯化鎘濃度呈梯度的培養基，具體為：

向TAgP中加入不同濃度梯度的氯化鎘，具體濃度為0mM,、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM。

優選的，所述根據萊茵衣藻在不同濃度呈梯度的培養基中的生長狀況，選擇重金屬鎘敏感型突變體篩選濃度和重金屬鎘抗性突變體篩選濃度，具體為：

將培養好的野生型萊茵衣藻21gr分別滴在不同氯化鎘濃度梯度TAgP固體培養基上，培養五天后，觀察記錄，根據具體結果，選取0.4mM氯化鎘作為用于篩選重金屬鎘敏感型突變體的篩選濃度和0.6mM氯化鎘作為用于篩選重金屬鎘抗性突變體的篩選濃度。

優選的，所述電擊轉化獲得萊茵衣藻突變體，包括：

制備aphⅧ目的片段；

配備經過過濾除菌的0.4％PEG6000和以TAP為基礎的培養基和預設細胞濃度的萊茵衣藻；

制備萊茵衣藻感受態細胞；

電擊獲得萊茵衣藻突變體；

細胞涂板；

挑取細胞轉化子。

優選的，所述制備aphⅧ目的片段，具體包括：

通過構建的質粒pJMG-aphⅧ，所述質粒pJMG-aphⅧ含有Paro抗生素篩選的DNA片段(aphⅧ)；采用EcoR Ⅰ酶切，膠回收aphⅧ片段；

預設細胞濃度的萊茵衣藻包括：將萊茵衣藻21gr在TAP吹氣瓶中培養至對數期后，轉接到200mL的三角瓶中，置于搖床培養8-16小時，以200rpm的轉速并連續光照；直至細胞濃度為4x10⁶cells/ml。

優選的，所述電擊獲得萊茵衣藻突變體，包括：

在電擊杯中加入250ul衣藻感受態細胞和aphⅧ目的片段100-200ng；在電擊儀BTX ECM630進行電擊，電擊最佳時間為10ms到14ms；電擊完畢后，立即將電擊杯放置冰上，靜置5-10min；其中，在制備衣藻感受態細胞和電擊轉化過程中，需要保持細胞處于無菌狀態。