[發明專利]PCR擴增引物及其應用

在審

• 申請號: 201611020980.7
• 申請日: 2016-11-18
• 公開（公告）號: CN108070586A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 許謙;陳璟;王云霞
• 申請（專利權）人: 杭州拓宏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發明公開了PCR擴增引物，該PCR擴增引物包括：上游引物和下游引物，所述上游引物為：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXXXAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA，所述下游引物為：CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTXXXXXXAAAGAATGGTCCTGCACCAG。該PCR擴增引物能夠有效用于待測樣品DNA尤其是糞便脫落細胞總DNA中Kras基因突變的檢測，且檢測結果準確可靠。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，具體涉及糞便脫落細胞總DNA中Kras基因突變的檢測。

背景技術

糞便中脫落細胞DNA中Kras突變及其水平是無創大腸癌風險評估的一個重要指標。然而，現階段糞便中脫落細胞總DNA中Kras突變的檢測方法十分繁瑣，且一些突變容易被遺漏。

因而，目前的糞便中脫落細胞總DNA中Kras突變的檢測方法仍有待改進。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠準確檢測糞便脫落細胞總DNA中Kras基因突變的手段。

需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發明構思和工作而完成的：

美國Exact Sciences Corporation公司開發了無創大腸癌篩查服務Cologuard，他們使用一種叫作Quantitative Allele-specific Real-time Target and SignalAmplification(QuARTS)的方法來檢測有關突變水平。這種方法首先是基于一種常用的基因突變檢測技術：擴增阻礙突變系統(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)PCR。ARMS-PCR的基本原理是將引物3’端設計在突變位置，這引起引物在此位置的區別性錯配而實現特異性擴增阻礙，從而區分野生型片段與有突變堿基的片段。QuARTS用到的另一項技術是基于Taqman的熒光定量PCR(qPCR)技術，不同于一般的qPCR反應，Taqman-qPCR反應除兩個引物之外又在擴增區間另外設計了能夠結合模板的寡核苷酸探針，隨著擴增反應延伸到探針結合區域，探針會被聚合酶的外切酶活性切割而釋放出來，而這能夠激發一個產生熒光的次級反應。這樣，通過這兩種技術的結合，QuARTS能夠通過突變特異ARMS引物對各種Kras突變進行定量。目前，國內的諾輝健康等公司的大腸癌早篩也是使用相近的技術路線。

發明人經過多次實驗研究認為，上述策略有兩個潛在的問題：第一、qPCR本身是一種半定量的方法，而這種以qPCR為基礎的、先釋放探針片段然后激發熒光的二級反應的設計雖然可以放大信號，但存在信號扭曲的可能；第二、ARMS-PCR需要對每個SNP設計特定的引物，因而能檢測的突變完全受限于對應的引物。迄今已報道的與腸癌相關的Kras突變有30個，而分別進行30個獨立的qPCR反應是十分繁瑣的。對此Exact Sciences的解決辦法是檢測七個最常見的Kras突變(12C、12D、12V、12S、13D、12A、12R)，但這導致其它致癌突變被遺漏。