[發明專利]一株利用木糖高效發酵乙醇的轉基因工程釀酒酵母SF4

有效

• 申請號: 201611019716.1
• 申請日: 2016-11-18
• 公開（公告）號: CN106701605B
• 公開（公告）日: 2020-01-24
• 發明（設計）人: 彭良才;郝勃;夏濤;涂媛媛;王艷婷;涂芬;熊科;魏小洋
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/62;C12R1/865
• 代理公司: 42001 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 黃瑞棠

本發明公開了一株利用木糖高效發酵乙醇的轉基因工程釀酒酵母SF4，涉及釀酒酵母技術領域。釀酒酵母SF4是通過寡肽鏈[?(G4S1)3?]鏈接的2個木糖利用酶即木糖還原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2構成的融合蛋白基因；XYL1的基因序列如SEQ ID NO：1，XYL2的基因序列如SEQ ID NO：2，融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3。將轉基因工程釀酒酵母SF4應用于秸稈水解產物的乙醇發酵中。本發明的SF4菌株生長量比對照提高1.5倍；葡萄糖和木糖共發酵的發酵時，SF4菌株木糖利用率達到53.8%；芒草材料水解液的乙醇發酵中，乙醇產量菌株SF4提高4.5倍左右。

技術領域

本發明涉及釀酒酵母技術領域，尤其涉及一株利用木糖高效發酵乙醇的轉基因工程釀酒酵母SF4。

背景技術

木糖是秸稈水解產物中含量最豐富的一種五碳糖，但是卻不能被傳統的釀酒酵母所利用。充分將木糖轉化成乙醇是秸稈資源合理有效利用的關鍵性環節。應用基因工程構建重組酵母菌株，提高其木糖發酵能力在理論上完全可行，故近三十年來，國內外已有大量的轉基因工程技術手段應用于改良釀酒酵母的報道，旨在獲得和提高釀酒酵母發酵木糖的能力。雖已取得一定的進展，但相關轉基因酵母仍然存在以下問題：1、乙醇產率較低；2、乙醇及發酵抑制物的耐受性不高；3、重組菌株穩定性不好；4、高濃度糖的耐受性不高。

發明內容

本發明的目的就在于克服現有技術存在的缺點和不足，提供一株利用木糖高效發酵乙醇的轉基因工程釀酒酵母SF4。

本發明的目的是這樣實現的：

一、轉基因工程釀酒酵母SF4（簡稱釀酒酵母SF4）

釀酒酵母SF4是通過寡肽鏈[-(G4S1)3-]鏈接的2個木糖利用酶即木糖還原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2構成的融合蛋白基因；

XYL1的基因序列如SEQ ID NO：1，XYL2的基因序列如SEQ ID NO：2，融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3；

釀酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中國典型培養物保藏中心（地址：中國 武漢 武漢大學 郵編：430072），保藏編號為CCTCC NO：M 2016563。

該融合蛋白基因被證實不僅能夠使天然不能利用木糖的釀酒酵母獲得利用木糖的能力，能以木糖作為唯一碳源轉化成為乙醇，還能夠在以單一木糖、木糖+葡萄糖或稻草等秸稈水解液的發酵中，進行高效乙醇發酵。

二、釀酒酵母SF4的獲得方法

將木糖代謝途徑中關鍵酶基因木糖還原酶基因xyl1和木糖醇氧化酶基因xyl2通過寡肽-（G₄S₁）₃-DNA序列連接，然后與木酮糖激酶基因 xks1一道構建到整合型表達載體pAUR101上，并轉化到高溫釀酒酵母SF7中。

對得到的釀酒酵母轉化子進行生長曲線測定，轉錄水平測定，蛋白表達含量測定，酶活測定，木糖唯一碳源發酵產物含量測定，木糖葡萄糖共發酵產物含量測定，芒草秸稈材料稀硫酸預處理酶解后發酵產物含量測定實驗。

三、轉基因工程釀酒酵母SF4的應用

秸稈是最豐富的資源之一，我國每年未被利用的農作物秸稈資源達5億噸之多；農作物秸稈的基本成分是半纖維素、纖維素和木質素，這三者大約各占30%的比例；傳統的釀酒酵母只能利用其中的纖維素分解產物，這是以秸稈釀造乙醇未能產業化的重要瓶頸之一。

將轉基因工程釀酒酵母SF4應用于秸稈水解產物的乙醇發酵中；

除了具備傳統的釀酒酵母生產菌株對該產物中纖維素分解后的6碳糖高效利用以外，還能夠高效發酵利用該產物中半纖維素分解后的5碳糖，大大提高對原料資源的利用率。

本發明具有下列優點和積極效果：