[發(fā)明專利]美洲大蠊wingless基因全長鑒定及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611019059.0
• 申請日: 2016-11-17
• 公開（公告）號: CN106854650B
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳婉;胡超超
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇開放大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12N15/10;C12Q1/6888;C12N15/11;A01N37/46;A01P7/04
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮;寧菁

1.一種美洲大蠊wingless基因全長cDNA，其特征在于，該基因序列GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號為KJ680328；所述的cDNA全長序列共1,456bp，其開放閱讀框包含1,194個核苷酸，編碼397個氨基酸，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.一種如權(quán)利要求1所述的基因序列編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.一種如權(quán)利要求1所述的美洲大蠊wingless基因全長cDNA的克隆方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)對從美洲大蠊樣本中提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；

2)以步驟1)中獲得的cDNA為模板，簡并如SEQ ID NO.3所示的引物F1和如SEQ ID NO.4所示的R1為上游引物和下游引物，進行PCR擴增；

3)在對步驟2)中擴增所得的PCR產(chǎn)物進行回收、連接、轉(zhuǎn)化，以及鑒定和測序；

4)將步驟1)中所獲得的RNA作為模板，構(gòu)建RACE cDNA文庫；獲得的產(chǎn)物為5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA，可分別作為5'-RACE和3'-RACE反應(yīng)的模板；

5)根據(jù)步驟3)中所獲得的基因序列設(shè)計3'RACE和5'RACE引物，分別以步驟4)中所獲得的5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA為模板，并使用UPM引物，其核苷酸序列為：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，進行5'-RACE或3'-RACE巢式PCR擴增美洲大蠊wingless基因的全長序列；

所述的3'-RACE和5'-RACE引物的核苷酸序列分別為：

3’RACE-F1：如SEQ ID NO.5所示；

3’RACE-F2：如SEQ ID NO.6所示；

5’RACE-R1：如SEQ ID NO.7所示；

5’RACE-R2：如SEQ ID NO.8所示；

6)回收、連接和轉(zhuǎn)化步驟5)中擴增所得的第一次巢式PCR的5’RACE和3’RACE的PCR產(chǎn)物；

7)將步驟3)中獲得的wingless基因序列與步驟6)中獲得的5’RACE基因序列進行拼接，根據(jù)拼接好的基因序列設(shè)計第二次巢式PCR的5'RACE引物，并以步驟4)中所獲得的5'-RACE-Ready cDNA為模板，第二次巢式PCR擴增美洲大蠊wingless基因的全長序列；所述的第二次巢式PCR的5'-RACE引物的核苷酸序列分別為：

5’RACE-R3：如SEQ ID NO.9所示；

5’RACE-R4：如SEQ ID NO.10所示。

8)在對步驟7)中擴增所得的第二次巢式PCR的5’RACE的PCR產(chǎn)物進行回收、連接、轉(zhuǎn)化，以及鑒定和測序；

9)將步驟3)中獲得的wingless基因序列，步驟6)中獲得的5’RACE和3’RACE基因序列與步驟8)中獲得的5’RACE基因序列進行拼接，得到wingless基因全長序列，經(jīng)BLAST比對驗證其為美洲大蠊wingless基因全長cDNA序列。

4.如權(quán)利要求3所述的一種如權(quán)利要求1所述的美洲大蠊wingless基因全長cDNA的克隆方法，其特征在于，步驟2)中，其PCR反應(yīng)條件如下：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35cycles；72℃10min；4℃保存。

5.如權(quán)利要求4所述的一種如權(quán)利要求1所述的美洲大蠊wingless基因全長cDNA的克隆方法，其特征在于，步驟5)中，第一輪PCR反應(yīng)條件為：94℃30s，72℃3min，5個循環(huán)；94℃30s，68℃30s，72℃3min，5個循環(huán)；94℃30s，65℃30s，72℃3min，15個循環(huán)；72℃10min；4℃保存；優(yōu)選地，第二輪PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃2min，20個循環(huán)；72℃10min；4℃保存。