[發(fā)明專利]一種KAP13-1基因在綿羊毛纖維細度鑒定中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611018055.0
• 申請日: 2016-11-18
• 公開（公告）號: CN106699882B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發(fā)明（設計）人: 余梅;楊萬寶;肖玉凈;李新云;李小平;曹建華;趙書紅
• 申請（專利權）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/10;G01N33/68
• 代理公司: 42001 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 張紅兵<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發(fā)明涉及一種KAP13‐1基因在綿羊毛纖維細度鑒定中的應用。根據(jù)牛KAP13‐1基因設計引物，以綿羊皮膚cDNA為模板，RT‐PCR綿羊KAP13‐1基因片段；根據(jù)綿羊KAP13‐1基因的氨基酸序列制備多克隆抗體，用免疫組化檢測KAP13‐1基因在綿羊毛囊中表達量；(3)利用2A肽序列構(gòu)建綿羊啟動子驅(qū)動的共表達綿羊KAP13‐1和綠熒光蛋白的重組載體；以KAP13‐1基因和ZsGreen1‐1載體中綠熒光蛋白基因設計引物；融合PCR得到KAP13‐1‐2A‐ZSG，用連接酶將KAP13‐1‐2A‐ZSG連接到雙酶切載體中；以綿羊脾臟基因組為模板擴增KAP11‐1基因啟動子，酶切連接到中間載體中獲重組載體(4)用重組載體轉(zhuǎn)化昆明小鼠，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性小鼠毛纖維皮質(zhì)部中的表達量，并檢測距離毛囊底部130μm處毛纖維的直徑。

技術領域

本發(fā)明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及一種KAP13-1基因在綿羊毛纖維細度鑒定中的應用。

背景技術

毛囊是一個復雜的微器官，其由外到內(nèi)包括外根鞘、伴隨層、內(nèi)根鞘(亨利層、赫胥黎層、鞘小皮)、毛干(角質(zhì)層、皮質(zhì)層、髓質(zhì)層)。此外，毛囊具有毛囊干細胞富集的膨大部、含有大量快速增殖細胞的毛母質(zhì)和在信號交流中起重要作用的毛乳頭。研究毛囊不同結(jié)構(gòu)或細胞的功能有助于全面地了解毛囊生長發(fā)育過程進而提高毛纖維品質(zhì)。毛纖維作為毛囊的最終產(chǎn)物，不僅對動物自身具有重要的保護作用而且具有很大的經(jīng)濟價值。毛纖維主要由外側(cè)的鱗片層、中間的皮質(zhì)層和內(nèi)部的髓質(zhì)層組成。皮質(zhì)層由角蛋白和角蛋白關聯(lián)蛋白組裝成的纖維束構(gòu)成，是毛纖維的重要組成部分。皮質(zhì)層中的蛋白通過鹽鍵、氫鍵及二硫鍵相互作用使毛纖維富有彈性、張力和韌性；皮質(zhì)層含有色素細胞，決定毛纖維顏色的深淺；而且皮質(zhì)層控制毛纖維的水分和曲直。因此，毛纖維的皮質(zhì)部對毛纖維的物理特性具有重要作用。研究皮質(zhì)部蛋白的功能可以揭示毛纖維的形成過程和各蛋白對毛纖維理化性質(zhì)的影響。

毛纖維中的角蛋白關聯(lián)蛋白(Kertain associated protein)是在皮質(zhì)部中圍繞角蛋白(Kertain)的不規(guī)則基質(zhì)的重要組成部分(Rogers and Schweizer,2005)。許多研究者認為角蛋白關聯(lián)蛋白在毛纖維形成過程中具有重要作用(Shimomura and Ito,2005；Fujikawa et al.,2012)。在毛纖維形成過程中，角蛋白關聯(lián)蛋白好像“膠水”一樣將各角蛋白結(jié)合起來(Rogers and Schweizer,2005)。根據(jù)氨基酸組成，角蛋白關聯(lián)蛋白可以分為高硫、超高硫和高甘氨酸/酪氨酸角蛋白關聯(lián)蛋白(Shimomura and Ito,2005)。高硫和超高硫角蛋白關聯(lián)蛋白主要通過與角蛋白形成二硫鍵在毛纖維的形成中發(fā)揮作用；而高甘氨酸/酪氨酸角蛋白關聯(lián)蛋白不僅可以與角蛋白相互作用而且還可以與細胞橋粒作用促進毛纖維的形成(Matsunaga et al.,2013)。角蛋白關聯(lián)蛋白在哺乳動物中特異表達，并且具有許多特點。首先，不同種類的角蛋白關聯(lián)蛋白與不同的毛纖維的特性有密切聯(lián)系；其次，由于角蛋白關聯(lián)蛋白半胱氨酸富集區(qū)段的重復導致長度的多態(tài)性，而半胱氨酸的含量差異導致了相應角蛋白關聯(lián)蛋白對毛纖維形成作用的差異；不同角蛋白關聯(lián)蛋白基因的多樣性也影響了其表達量的不同(Wu et al.,2008；Khan et al.,2014)。因此，角蛋白關聯(lián)蛋白的多樣性很可能導致了哺乳動物毛纖維形態(tài)的多樣性。

KAP13-1屬于高硫角蛋白關聯(lián)蛋白。公開號：CN103642806B的專利文獻報道了綿羊KAP13-1在毛囊中高表達。在羊毛纖維的蛋白質(zhì)組學研究中，KAP13-1的表達起始于羊毛纖維角質(zhì)化部位(Plowman et al.,2015)。此外，在不同品種的綿羊群體中，KAP13-1在不同位點呈現(xiàn)出多態(tài)性，進一步的關聯(lián)分析表明KAP13-1中的多態(tài)位點與產(chǎn)毛量、柔韌性及產(chǎn)絨性狀存在緊密關聯(lián)。上述結(jié)果表明KAP13-1對毛纖維的形成具有重要作用，但是其具體功能尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提高一種KAP13-1基因在綿羊毛纖維細度鑒定中的應用，檢測綿羊KAP13-1對毛纖維細度的影響，利用該基因作為在綿羊毛纖維細度鑒定中的應用。