[發明專利]一種細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201611016636.0
• 申請日: 2016-11-18
• 公開（公告）號: CN106701915B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 肖冰冰;牛小溪
• 申請（專利權）人: 北京大學第一醫院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686
• 代理公司: 北京知聯天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11594
• 代理人: 王沖

本發明提供了一種應用LH?PCR技術，制備細菌性陰道病的細菌基因指紋圖譜的方法，以及應用該細菌基因指紋圖譜進行細菌性陰道病臨床精確診斷的用途。本發明所述的細菌基因指紋圖譜能用于細菌性陰道病的臨床快速診斷，避免傳統的細菌分離培養的診斷不準確、操作繁瑣、耗時長、工作量大以及高通量測序價格昂貴等缺點，能夠準確、快速有效地檢測陰道內的菌群分布狀況。

技術領域

本發明涉及一種細菌基因指紋圖譜的制備方法，具體的說涉及一種應用LH-PCR技術制備細菌性陰道病的細菌基因指紋圖譜的方法。

背景技術

細菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)是由細菌引起的陰道感染，是育齡期女性常見的下生殖道感染性疾病，其可引發多種不良妊娠結局，如自然流產、早產、羊水感染、產后子宮內膜炎和剖腹產切口感染及圍產兒并發癥等。近年來的研究發現，細菌性陰道病的復發和持續感染還能增加滴蟲性陰道炎、白假絲酵母菌性陰道炎、宮頸癌和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的風險。

目前對細菌性陰道病的病因，特別是對細菌性陰道病患者的陰道菌群構成的差異，缺乏深入研究。以往使用的培養法并不能全面地反映陰道菌群的構成，導致對細菌性陰道病患者的病原菌研究受到局限，有時患者臨床評價雖已是治愈狀態，但其陰道菌群構成卻還沒有恢復到正常狀態，致病菌仍存在，此時如僅通過臨床評價停止治療，則會導致細菌性陰道病復發，耽誤疾病治療，增加疾病的復發率。

隨著近20年來分子生物學技術的快速發展，使用分子生物學方法研究細菌性陰道病復發的機理和細化診斷臨床不同細菌性陰道病亞型成為一種趨勢，人們對細菌性陰道病的菌群結構研究也在不斷深入。長度多態片段PCR(length heterogeneity PCR，LH-PCR)是運用熒光標記的探針來決定來源于不同微生物擴增序列的相對數量，帶標記的片段通過毛細管電泳被分離出來，而后被一個帶有熒光性的自動基因序列分析儀所監測到。LH-PCR是一種分析微生物結構的方法，其原理是由于基因或基因操縱子的插入或剪切造成某些特定基因固有長度呈現多態性。因此，可以利用這種多態性來確定微生物的種群信息。LH-PCR測定的超變量區域主要存在于核糖體的小亞基(rrn)。

LH-PCR作為一種基于PCR的分子指紋圖譜技術，其與高通量測序技術相比具有技術操作靈敏，快速簡單，成分低廉等的優點。但是，目前尚未有將該技術應用于醫學領域，尤其是將其作為一種疾病的診斷技術的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種應用LH-PCR技術，制備細菌性陰道病的細菌基因指紋圖譜的方法，以及應用該細菌基因指紋圖譜精確判斷樣品中是否存在細菌性陰道病致病菌群的用途。本發明所述的細菌基因指紋圖譜能用于細菌性陰道病的臨床快速診斷，避免傳統的細菌分離培養的診斷不準確、操作繁瑣、耗時長、工作量大以及高通量測序價格昂貴等缺點，能夠準確、快速有效地檢測陰道內的菌群分布狀況。

為達到上述目的，本發明提供一種細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，其中所述細菌為陰道內細菌，所述基因為16S rRNA基因。

進一步的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，是對擴增片段長度為310-380bp的基因片斷進行分析。

更進一步的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，其中當片段長度340-374bp中的任何一個片斷的相對峰面積大于10％時，確定為有細菌性陰道病致病菌群存在；當片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積都小于10％，確定為正常菌群，沒有細菌性陰道病致病菌群存在。

優選的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，其中LH-PCR的引物為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'的5'端用FAM熒光標記。