[發明專利]一種富集分離糖肽的方法

有效

• 申請號: 201611014765.6
• 申請日: 2016-11-18
• 公開（公告）號: CN108072719B
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 梁鑫淼;孫濤壘;李秀玲;卿光焱;姜舸;陸琦
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所;武漢理工大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及材料分析化學和翻譯后修飾蛋白組學等領域。本發明提供一種富集分離糖肽的方法，該方法是將響應性聚合物糖肽富集與蛋白酶解物接觸，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分離富集糖肽，并對樣品進行質譜分析，所述響應性聚合物響應性聚合物糖肽富集材料是利用表面引發?原子轉移自由基聚合反應機制，將異丙基丙烯酰胺和硫脲衍生物在基底材料表面經過共聚所得，所述基底材料的粒徑是0.2?50μm,孔徑為該方法通過對富集過程pH，溫度，有機相濃度等條件的控制，實現了復雜混合物(高非糖肽摻入比)中糖肽高選擇性、高重復性和高通量富集，顯著提高了糖蛋白中糖基化位點的鑒定數目。

技術領域

本發明涉及材料分析化學和有機化學領域，尤其涉及一種富集分離糖肽的方法。

背景技術

可逆的蛋白質糖基化在細胞生命活動中具有重要的調控作用，因此在分子水平研究蛋白質糖基化對揭示其在生命過程的調節機制意義重大。以質譜為基礎的蛋白組學方法是鑒定蛋白糖基化的常規方法。但是在質譜分析前，需要對低豐度的糖肽/糖蛋白進行選擇性的富集，以提高糖肽在質譜中信號強度和鑒定數目。已有的糖肽富集方法主要有凝集素法、肼化學法、硼酸法以及親水作用色譜法等。但是這些方法都存在一定的局限性：凝集素親和作用色譜存在糖基化覆蓋率低的問題[Kubota,et al.Anal.Chem.2008]；肼化學對糖肽的選擇性高，但是在洗脫過程中破壞糖鏈[Zhang,H.；et al.Nat.Biotechnol.2003.]；硼酸化學法和親水作用色譜法在抓取糖肽時存在一定的非特異性吸附，選擇性有待提高。因此，為了實現復雜生物樣品中大規模富集糖肽的目的，亟需一種簡單高效，在保證糖肽覆蓋率的同時又能有效排除非糖肽干擾的新型富集方法。

發明內容

本發明為解決上述技術問題提供一種具有高選擇性、高吸附量、操作簡單和重復性好的富集分離糖肽的方法，能對低化學計量的糖肽進行選擇性富集和分離。

本發明的技術方案如下：

一種富集分離糖肽的方法，該方法是將響應性聚合物糖肽富集材料與蛋白酶解物接觸，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分離富集糖肽，并對樣品進行質譜分析，所述響應性聚合物糖肽富集材料為：

其中x＝0.1～0.9(x和1－x用于代表其下方對應單體數量之間的相互關系，/代表單體間順序連接聚合)；n＝10²～10⁶；R為氨基酸、單糖、二糖、二肽、氨基酸數為2～4的寡肽和兩性離子化合物。所述響應性聚合物糖肽富集材料是利用表面引發-原子轉移自由基聚合反應機制，將異丙基丙烯酰胺和硫脲衍生物在基底材料(Matrix)表面經過共聚所得；所述基底材料為Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一種或者兩種以上任意比例的混合；所述基底材料的粒徑是0.2-50μm,孔徑為

上述方案中，采用柱固相萃取模式(SPE)，具體步驟如下：

1)在SPE模式下，首先將響應性聚合物材料加載到末端帶有篩板的移液槍槍頭或者SPE小柱上，采用洗脫液沖洗材料，之后用上樣液平衡材料，然后將溶解在上樣液中的樣品加載到材料上，之后采用淋洗液沖洗材料除去非糖肽，最后用洗脫液洗脫材料上的糖肽；在dSPE下，將富集材料放在離心管中，采用洗脫液沖洗材料，然后用上樣液平衡材料，之后把材料與溶解在上樣液中的樣品混合，孵化時間10-120分鐘，離心棄上清液，沉淀部分用沖洗液沖洗需要振蕩3-10分鐘，離心取上清液，濃縮即為非糖肽，沉淀部分用洗脫液洗脫糖肽需要震蕩5-30分鐘，濃縮即為糖肽。

2)上樣液組成為緩沖鹽溶液或酸水溶液與有機溶劑的混合液，有機溶劑的比例為70-85％，pH在1-5范圍內，緩沖鹽的濃度為0-50mM，酸水溶液中酸的濃度為0.1％-5％