[發明專利]一種含有肝脫細胞基質成分的肝細胞培養液及應用

在審

• 申請號: 201611011382.3
• 申請日: 2016-11-17
• 公開（公告）號: CN108070550A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 孫廣煒;孫東升;劉洋;張英;趙姍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種含有肝脫細胞基質成分的肝細胞培養液，其特征在于：此培養液在基礎培養液的基礎上，添加了肝脫細胞基質溶液，并補充了胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉、地塞米松及胎牛血清；

所述基礎培養液為DMEM培養液、F12培養液、DMEM/F12培養液、MEM培養液中的一種或二種以上的混合液；

所述培養液中肝脫細胞基質溶液的濃度為5-30％(v/v)；

所述培養液中胰島素的濃度為5-100μg/L；

所述培養液中轉鐵蛋白的濃度為1-10mg/L；

所述培養液中亞硒酸鈉的濃度為2-10μg/L；

所述培養液中地塞米松的濃度為0.1-10μg/L；

所述培養液中胎牛血清的濃度為5-20％(v/v)。

2.按照權利要求1所述的肝細胞培養液，其特征在于：

所述肝脫細胞基質溶液為動物肝臟經過加工制成；所述肝脫細胞基質溶液的制備包括以下兩個過程：

(1)肝脫細胞基質顆粒的制備：取健康動物的完整肝葉凍存于-70至-80℃；冷凍24-48h后用切片機將肝葉切成3-5mm厚的肝組織片，將肝組織片與脫細胞液按1/10-1/20(w/v，g/ml)比例混合置于恒溫搖床振搖(0-4℃，100-200轉/分)去除肝細胞，脫細胞液成分以及處理時間依次為：雙蒸水、72h；1％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水溶液、48h；0.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液、24h；雙蒸水、72h。處理后的肝脫細胞組織片在-70至-80℃冷凍后，經液氮研磨儀粉碎為粒徑500-1000μm大小顆粒后冷凍干燥；

(2)肝脫細胞基質顆粒的溶液化：將冷凍干燥后的肝脫細胞顆粒與1mg/mL胃蛋白酶溶液(溶劑為0.1mol/L鹽酸)按10mg：1mL比例混合，經攪拌36-72h(20-25℃，400-600轉/分)，離心10-30min(0-4℃，8000-12000轉/分)后取上清，加入1-4mol/L氫氧化鈉溶液調節上清pH至8.4-8.6永久滅活胃蛋白酶后，離心20-60min(0-4℃，12000-14000轉/分)后取上清，上清溶液再依次經0.8μm、0.45μm以及0.22μm無菌濾膜過濾，透過濾膜的濾液置于0-4℃保存。

3.按照權利要求2所述的肝細胞培養液，其特征在于：

所述動物包括豬、牛、猴、兔、狗、貓、小鼠、大鼠中的一種或二種以上。

4.一種權利要求1-3任一所述肝細胞培養液的應用，其特征在于：此培養液用于肝細胞的體外培養。

5.按照權利要求4所述肝細胞培養液的應用，其特征在于：所述肝細胞包括人和/或哺乳動物來源的原代肝細胞、永生化肝細胞株、干細胞來源肝細胞或肝細胞聚集體中的一種或二種以上；哺乳動物為豬、牛、猴、兔、狗、貓、小鼠、大鼠中的一種或二種以上。