[發(fā)明專(zhuān)利]一種Lewis血型抗原檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611006874.3
• 申請(qǐng)日: 2016-11-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107630080A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 虞先濬;羅國(guó)培;劉辰;郭萌;金凱舟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6869
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種Lewis血型抗原檢測(cè)方法。更具體而言，涉及通過(guò)一步測(cè)序法測(cè)定Lewis血型抗原的基因型，并通過(guò)基因型確定Lewis抗原的表型的方法，本方法能提高檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確性。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了Lewis血型抗原的合成和表達(dá)是在前體糖鏈基礎(chǔ)上通過(guò)多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶連續(xù)作用形成的。研究報(bào)道，與紅細(xì)胞有關(guān)的Lewis血型抗原主要有Le^a和Le^b，兩個(gè)同源基因FUT2和FUT3共同決定4種Lewis表型，其中FUT3基因決定Lewis抗原的表達(dá)與否，而FUT2基因決定Lewis抗原的表達(dá)的表達(dá)量。研究還表明了在I型前體糖鏈基礎(chǔ)上，通過(guò)FUT2酶(存在于分泌型個(gè)體中)作用形成H糖鏈，進(jìn)一步通過(guò)FUT3酶形成Le^b抗原和紅細(xì)胞Le(a-b+)表型；當(dāng)FUT2酶失活(非分泌型個(gè)體)無(wú)法形成分泌型H糖鏈時(shí)，F(xiàn)UT3酶直接作用于I型前體糖鏈形成Le^a抗原和紅細(xì)胞Le(a+b-)表型；當(dāng)FUT2酶部分失活(弱分泌型個(gè)體)時(shí)，則同時(shí)形成Le^a、Le^b抗原和紅細(xì)胞Le(a+b+)表型；當(dāng)FUT3基因變異導(dǎo)致功能性的FUT3酶缺陷時(shí)，無(wú)論個(gè)體是否具有功能性的FUT2，其前體糖鏈均無(wú)法進(jìn)一步形成Le^a或Le^b抗原，表現(xiàn)為紅細(xì)胞Le(a-b-)表型。

鑒于臨床已有若干關(guān)于Lewis血型抗原不符引起的輸血相關(guān)性溶血反應(yīng)的報(bào)道，而且，尤其，Lewis血型抗原的相關(guān)基因FUT2和FUT3多肽性與多種疾病的疾病易感性有密切聯(lián)系，包括幽門(mén)螺旋桿菌感染、潰瘍性結(jié)腸炎、胃癌、腸癌及多種感染性疾病，更為重要的是，Lewis血型抗原系統(tǒng)決定了CA19-9的表達(dá)與分泌，Lewis抗原陰性(約占人群的5-10％)無(wú)法分泌CA19-9，而CA19-9是目前胰腺癌中重要的、應(yīng)用廣泛的標(biāo)記物的現(xiàn)狀，因此，Lewis抗原血型檢測(cè)具有重要的臨床意義。

目前檢測(cè)Lewis血型抗原的方法主要為通過(guò)抗原凝集反應(yīng)，其中使用的標(biāo)本多為血液。由于機(jī)體內(nèi)組織包括消化道粘膜等合成Lewis抗原后分泌至組織間隙中，包括血液、消化液等，紅細(xì)胞吸附Lewis抗原至其表面；由于紅細(xì)胞自身無(wú)法合成與分泌Lewis抗原，導(dǎo)致通過(guò)血液、消化液的Lewis抗原的檢測(cè)存在較多假陽(yáng)性和假陰性，如國(guó)際著名的腫瘤學(xué)期刊《臨床腫瘤學(xué)雜志》(《Journal of Clinical Oncology》)報(bào)道Lewis抗原陰性的胰腺癌患者高達(dá)30％。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種新的Lewis血型抗原檢測(cè)方法。具體涉及通過(guò)基因測(cè)序方法測(cè)定Lewis抗原相關(guān)基因的基因型，通過(guò)基因型確定Lewis抗原的表型得方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目地是為克服現(xiàn)有技術(shù)的抗原凝集反應(yīng)檢測(cè)Lewis血型抗原方法的不足，提供一種新的Lewis血型抗原檢測(cè)方法。尤其涉及通過(guò)一步測(cè)序法測(cè)定Lewis血型抗原的基因型，并通過(guò)基因型確定Lewis抗原的表型的方法，本方法能提高檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確性。

本發(fā)明通過(guò)基因測(cè)序方法測(cè)定Lewis抗原相關(guān)基因的基因型，通過(guò)基因型確定Lewis抗原的表型。

具體的，本發(fā)明的Lewis血型抗原檢測(cè)方法，其特征在于，其包括步驟：

1)設(shè)計(jì)檢測(cè)Lewis血型抗原的多重PCR反應(yīng)引物，以及設(shè)定特定的PCR反應(yīng)條件，將所有位點(diǎn)通過(guò)一個(gè)PCR反應(yīng)完成；

2)通過(guò)第一代測(cè)序方法檢測(cè)Lewis相關(guān)基因FUT2和FUT3的基因型，并通過(guò)基因型確定Lewis抗原表型。

本發(fā)明方法中，多重PCR反應(yīng)的引物序列下式所示：

本發(fā)明方法中，使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒提取基因組DNA；使用微型離心機(jī)或真空處理從全血或淋巴細(xì)胞中提取總基因組DNA。

本發(fā)明方法中，PCR擴(kuò)增的位點(diǎn)包括FUT3：59，202，314位點(diǎn)(358F/R)，508，1067位點(diǎn)(P1F/P1R)，以及FUT2：357，385，428，571，739位點(diǎn)(FUT2 1F/2R)；PCR反應(yīng)條件：1:94℃5min；2:94℃30s；3:Tm 62℃30s；4:72℃30s(To step2 38cycles)；5:72℃10min。

本發(fā)明方法中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳：控制電壓保持在110V，電流在40mA以上；用DNA marker標(biāo)記產(chǎn)物大小。